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RESOLUÇÃO NORMATIVA Nº 33, DE 18 DE NOVEMBRO DE 2016

Brasão do Brasil

Diário Oficial da União

Publicado em: 21/11/2016 | Edição: 222 | Seção: 1 | Página: 5

Órgão: Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações/CONSELHO NACIONAL DE CONTROLE DE EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL

RESOLUÇÃO NORMATIVA Nº 33, DE 18 DE NOVEMBRO DE 2016

Baixa o Capítulo "Procedimentos - Roedorese Lagomorfos mantidos em instalaçõesde instituições de ensino ou pesquisa científica"do Guia Brasileiro de Produção, Manutençãoou Utilização de Animais em Atividadesde Ensino ou Pesquisa Científica.

O PRESIDENTE DO CONSELHO NACIONAL DE CONTROLEDE EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL - CONCEA, no uso dasatribuições que lhe confere o art. 5º da Lei nº 11.794, de 8 de outubrode 2008, resolve:

Art. 1º. Fica baixado o Capítulo "Procedimentos - Roedorese Lagomorfos mantidos em instalações de instituições de ensino oupesquisa científica" do Guia Brasileiro de Produção, Manutenção ouUtilização de Animais em Atividades de Ensino ou Pesquisa Científicado Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal,na forma do Anexo a esta Resolução Normativa.

Art. 2º. Esta Resolução Normativa entra em vigor na data desua publicação.

GILBERTO KASSAB

ANEXO

Procedimentos - Roedores e Lagomorfos mantidos em instalaçõesde instituições de ensino ou pesquisa científica

I - Introdução

É essencial conhecer a biologia da espécie, raça, linhagemcom a qual se trabalha, uma vez que as necessidades básicas (físicas,emocionais ou comportamentais) a serem satisfeitas não são as mesmaspara todos os animais. Conceito aplicável aos animais geneticamentemodificados, os quais podem apresentar necessidades especiaisdecorrentes da modificação genética.

Neste capítulo, trataremos das seguintes espécies: camundongo,cobaia, coelho, hamster e rato.

Os roedores possuem organização social complexa. Cadaanimal tem seu papel e a simples retirada ou adição de um animal emuma gaiola pode ter consequências consideráveis, que afetará o bemestarde todo o grupo. Uma característica importante e que deve serrespeitada é de serem gregários. O isolamento, portanto, causa sofrimentoe diminuição nos níveis de bem-estar. Quando o isolamentofor necessário (por exemplo, em casos de agressividade, doenças ouprotocolos de pesquisas), deve ser cientificamente justificado. Medidasmitigatórias do impacto do isolamento sobre o bem-estar devemser adotadas, como permear-se o contato visual, auditivo e olfatórioentre animais congêneres, reduzindo o estresse da separação.

1.1. Faz-se necessária a definição de alguns ambientes queserão citados ao longo do capítulo.

1.1.1 Instalações de manutenção: ambientes ou locais queofereçam condições necessárias para a manutenção do bem-estar animal,desde a sua saída da instalação de produção até o momento dadestinação prevista.

1.1.2. Instalações de produção: ambientes ou locais que ofereçamcondições necessárias à manutenção do bem-estar animal,compatíveis com as atividades a serem desenvolvidas na reproduçãoe criação de espécies animais para fins de ensino ou de pesquisacientífica.

1.1.3. Instalações de utilização: ambientes ou locais que ofereçamcondições adequadas para a realização dos protocolos requeridosnos projetos e que contemplem os cuidados necessários para amanutenção do bem-estar animal até a finalização das atividades deensino ou da pesquisa científica.

1.2. Espécies

1.2.1. Camundongo

O camundongo de laboratório é um mamífero da famíliaMuridae, subfamília Murinae, da ordem Rodentia e gênero Mus. Oseu nome científico é Mus musculus, o qual detém múltiplas linhas,incluindo três principais subespécies, com distribuição geográfica distinta.

Emgeral, os camundongos são dóceis, de fácil manuseio,ciclo de vida curto, fecundidade alta (potencial de reprodutibilidade),curta gestação e tamanho pequeno.

Essas características tornam os camundongos modelos deeleição para estudo de genética, teratologia e gerontologia. Nos estudosde genética, estima-se uma similaridade dos genomas do camundongoe do homem de 70% a 90% (Ko et al, 2008).

1.2.2. Rato

O rato de laboratório, ou rato Norway,éaformadomesticadada espécie Rattus norvegicus. Embora o gênero Rattus possuacerca de 300 espécies, a outra espécie mais conhecida é Rattus rattus,ou rato preto. O gênero pertence à ordem Rodentia e à famíliaMuridae. Os ratos são curiosos, inteligentes e exibem comportamentocom amplo repertório de ação. Eles tendem a ser dóceis, mostrandoagressividade somente na defesa de seus filhotes. O seu comportamentocomum inclui a posição em pé, usada para explorar o ambiente;enfrentamento, uma forma de recreação entre ratos jovens; elimpeza da pelagem. Os ratos são neofóbicos. Entretanto, interagemcom objetos novos colocados em seu ambiente. Os ratos têm hábitonoturno e geralmente têm três períodos de atividade: no início, nomeio e ao final da noite. Eles se alimentam durante esses períodos deatividade, fazendo três a cinco refeições. O êxito do rato Norway emtodo mundo deve-se, em parte, ao fato da espécie ser onívora e teruma notável capacidade para balancear os nutrientes ingeridos, dentroda diversidade de condições alimentares (Lapchik et al, 2008).

1.2.3. Cobaia

A cobaia (Cavia porcellus) é um roedor da família Cavidae,conhecido também como porquinho da Índia. A espécie mais utilizadaem pesquisas é a C. porcellus. As cobaias são animais sociáveis,tímidos, dóceis e raramente mordem ou arranham. Os adultos,frequentemente, mordem as orelhas dos jovens e os machos podembrigar violentamente, durante disputas por uma fêmea em estro, atéque se estabeleça a hierarquia do grupo. Assustam-se facilmente,defecam e urinam nos comedouros e derramam sua alimentação pelopiso da gaiola. Vocalizam demonstrando prazer antes de situaçõesgratificantes (alimentação) e ficam juntas ou em cima umas das outrasdurante o manejo da colônia pelo técnico. As cobaias podem seralojadas para reprodução em pares ou haréns e os recém-nascidosapresentam-se com os olhos abertos, pavilhão auricular descolado dacabeça e caminham logo após o parto. O desmame ocorre em 2-3semanas, mas geralmente o jovem alimenta-se com sólidos e águadentro de poucos dias após o nascimento. Em alguns países, é umanimal utilizado também na alimentação humana (Bueno et al,2008).

1.2.4. Hamster

O hamster sírio ou dourado (Mesocricetus auratus) é o maisutilizado com fins didáticos e científicos, pertencentes à família Cricetidae(ainda que alguns taxonomistas as coloquem entre os Muridae).Diferentemente de outros roedores usados em laboratórios, nãohá muitas informações sobre a biologia do hamster em vida livre.Apresentam hábitos noturnos, são curiosos e constroem tocas elaboradascom várias entradas. A fêmea, quando adulta, apresenta umporte superior ao do macho diferentemente da maioria dos roedores,em que o macho é maior que as fêmeas. Os machos não demonstramagressividade com as fêmeas, apenas com outros machos. Em cativeiro,é possível o agrupamento de indivíduos do mesmo sexo.Entretanto, para que se tenha sucesso nesse tipo de alojamento, énecessário que se formem os grupos no momento do desmame.

O hamster sírio é uma espécie sazonal, em vida livre, hibernamdurante os períodos de dias curtos, com baixa luminosidade, baixastemperaturas (inferiores a 5°C) e disponibilidade escassa de recursosalimentares e de material para construção de ninho (Mori et al, 2008).

1.2.5. Coelhos

Coelhos e lebres pertencem a uma ordem distinta, a doslagomorfos (ordem Lagomorpha). Portanto, não são roedores. O ancestraldo coelho doméstico (Oryctolagus cuniculus) é o coelho selvagem,um mamífero da ordem Lagomorpha com uma grande capacidadede adaptação a diferentes regiões climáticas. A domesticaçãodo coelho é, de fato, recente e não produziu ainda mudançassubstanciais no comportamento quando comparado ao coelho selvagem.Apesar da grande variedade entre as raças atuais, as característicascomportamentais pouco mudaram, mesmo com a domesticação,ou seja, nenhum padrão comportamental foi perdido oucriado. Vários tipos de comportamento mantêm-se: o comportamentode manutenção (recursos essenciais para a sobrevida e expressão dorepertório de comportamentos normais, alimentação, água, proteção),o comportamento materno e o comportamento social. A duração,frequência e intensidade com que os animais os expressam dependemda raça, das condições ambientais e, consequentemente, do nível deestresse a que são submetidos. Os coelhos são animais sociáveis que,em vida livre, vivem grande parte do tempo em grupo e em contatopróximo uns com os outros. As lutas não são frequentes porque ahierarquia é claramente definida, quando existe um ambiente quesimule uma aproximação ao ambiente natural (Moura & Mattaraia,2008).

II - Procedimentos para área de produção e manutenção deroedores e lagomorfos

As tarefas diárias em uma instalação de ensino ou pesquisacientífica destinada à produção e manutenção das cinco espécies tratadasneste capítulo (camundongo, cobaia, coelho, hamster e rato) sãobastante complexas, variam de acordo com a estrutura física, disponibilidadede equipamentos, necessidade fisiológica, comportamentale psicológica dos animais, padrão sanitário e genético dos animaise finalidade da produção. Uma forma eficiente e segura para que sealcance a realização das tarefas reunindo todos esses interesses, comsucesso e de maneira contínua, é a implantação dos ProcedimentosOperacionais Padrão (POPs), documento que descreve passo a passoas etapas cronológicas sucessivas para a realização do desenvolvimentode uma atividade, garantindo, assim, a padronização de tarefas.Na área de produção ou manutenção de animais, deve haver um POPpara cada atividade, desde as consideradas mais simples, como alimpeza das gaiolas, até o sistema de acasalamento específico paralinhagens transgênicas. Quando da elaboração de um POP, deve-seenvolver a colaboração de todos os funcionários que desempenham aatividade, inclusive responsável técnico, possibilitando assim, que osmesmos possam também estar preparados para diagnóstico e tratamentos/modificaçõesrápidas das não conformidades detectadas,evitando perdas nos padrões de qualidades alcançados nas atividadesem geral.

Todos os equipamentos devem ser regularmente validados eestar com as suas especificações, instruções de uso e de limpezafixadas próximo do equipamento, em local de fácil visibilidade.

A estrutura física das instalações de produção ou manutençãode animais é idealizada com o objetivo de atender à especificidade domodelo biológico que produz ou mantém. Entretanto, há áreas básicasque estão presentes em todas as instalações. Essas áreas estão detalhadamenteexplicitadas no Capítulo "Estrutura Física e Ambientespara Roedores e Lagomorfos".

Neste Capítulo, vamos descrever as atividades executadas nointerior das áreas destinadas direta ou indiretamente à produção oumanutenção de camundongos, cobaias, coelhos, hamster e rato.

2.1. Recinto primário e secundário

Nas instalações destinadas à produção e manutenção de roedorese lagomorfos, utilizados para ensino ou pesquisa científica, háduas grandes áreas comumente tratadas como área de produção deanimais ou área limpa e área de higienização, tradicionalmente chamadade área suja (nome considerado impróprio, uma vez que serefere a uma área restrita que guarda uma inter-relação com o queacontece na área de produção). Essa divisão fundamental entre asáreas ocorre devido às barreiras sanitárias que protegem a área limpa.Primordialmente, falamos das autoclaves de barreira (dupla porta) ede sistema de filtração de ar.

Na área de produção, temos as salas de animais, as quais sãodenominadas como macroambiente ou recintos secundários. As salasde animais devem ter ambiente controlado e suas variáveis registradasdiariamente. O ambiente mais próximo ao animal é denominado derecinto primário, nesse caso, a gaiola, também denominado de microambiente.Recentemente, o Conselho Nacional de Controle deExperimentação Animal - CONCEA estabeleceu parâmetros de temperatura,umidade, luminosidade, ruído, vibração e espaço mínimopara produção ou manutenção de roedores e lagomorfos, no Capítulo"Estrutura Física e Ambientes para Roedores e Lagomorfos".

As espécies tratadas neste Capítulo são todas sociáveis, istoé, vivem em grupos. O ambiente destinado a elas deve permitiralojamento em pares ou grupos, sendo desaconselhado o alojamentoindividual, o qual necessita de justificativa robusta e aprovação daCEUA institucional para que aconteça.

O ambiente primário, a gaiola, deve suprir as necessidadesbásicas dos animais e permitir que o animal desenvolva seu repertóriocomportamental pertinente à sua fase de desenvolvimento. A gaiolaprecisa ser segura para evitar fuga dos animais, mas, também, commaterial impermeável, atóxico e não apresentar pontos de risco no seuinterior, como ângulos, arestas, saliências, ranhuras ou bordas quepossam ferir ou machucar os animais, bem como evitar o acumulo desujeiras. Um detalhe que requer muita atenção no ambiente primáriodos animais é o assoalho das gaiolas, que deve permitir a movimentaçãonatural dos animais, evitar derrapagens e lesões nas patas.Assoalhos gradeados devem ser substituídos, principalmente no casode reprodutores, devido ao peso de animais maiores e seu tempo depermanência nas gaiolas. Esse tipo de piso quase sempre causa lesõesnos membros posteriores de coelhos.

O ambiente primário deve estimular positivamente o animal,com desafios que previnam a ansiedade, frustração e o estresse crônico,mantendo bons níveis de bem-estar e, consequentemente, nãocomprometer os índices de seu desempenho (vide item sobre enriquecimentoambiental).

São diversas as atividades realizadas em uma instalação deprodução ou manutenção das espécies de animais de laboratório tratadasneste Capítulo, elas podem ocorrer diariamente, semanalmente emensalmente, dependendo da especificidade de cada atividade. Afrequência com que são realizadas mantem uma relação de dependênciacom características de espaço, infraestrutura e administraçãode cada instituição, bem como do protocolo de pesquisa.

2.2. Procedimentos para área de produção e manutenção deroedores e lagomorfos.

2.2.1. Alimentação e Hidratação

2.2.1.1. Alimento

O estado nutricional do animal pode influenciar o seu crescimento,reprodução, longevidade, seu nível de bem-estar, dentre outrosprocessos fisiológicos. Todas as cinco espécies (camundongo,cobaia, coelho, hamster e rato) devem receber uma dieta palatável,que forneça as necessidades nutricionais e comportamentais adequadasà espécie, exceto quando o estudo exija outro tipo de conduta e oprojeto tenha sido avaliado e aprovado pela CEUA. Os requerimentosnutricionais para roedores e lagomorfos citados neste Capítulo estãodefinidos nas publicações do National Research Council Committeeon Animal Nutrition.

O alimento mais usual no Brasil, para os roedores e lagomorfosmantidos em ambientes, com finalidade de ensino ou pesquisacientífica, são as rações comerciais produzidas a partir de alimentosnaturais, ou seja, dieta de fórmula aberta, elaborada a partir deprodutos agrícolas e derivados. Neste tipo de ração, pode haver umavariação na composição dos nutrientes, devido à variabilidade dasplantas, época de colheita, condições do tempo, procedimento decolheita, procedimentos de estocagem, métodos de fabricação e moagem,que influenciam a composição de nutrientes dos ingredientesusados nesses tipos de dieta e consequentemente levando à produçãode dois lotes da mesma dieta não idênticos. Essa variação nas concentraçõesdos nutrientes da dieta pode tornar-se uma variável nãocontrolada capaz de afetar resultados. Outra questão refere-se ao graude contaminação dos ingredientes naturais que ocorre naturalmentepela sua exposição a vários contaminantes ou causados pelo homem.A presença de resíduos de pesticida em baixas concentrações, que nãocause problemas na saúde do animal, pode afetar os resultados dapesquisa. Por exemplo, uma concentração de chumbo de 0,5-1,0 ppmé inerente em dietas de ingredientes naturais de roedores e geralmentenão é prejudicial à saúde animal, mas poderia influenciar substancialmenteos resultados de estudos toxicológicos projetados para avaliaremcompostos a serem testados que contenham chumbo.

Dietas certificadas são aquelas que foram previamente testadaspara constatação de contaminantes e produzidas de acordo comas exigências de Boas Práticas de Laboratório (BPL).

Dietas purificadas são formuladas com ingredientes que foramrefinados de maneira que cada ingrediente contém um úniconutriente ou classe de nutriente. As concentrações de nutrientes nessetipo de dieta são menos variáveis e mais controladas que nas dietas deingredientes naturais.

Dietas quimicamente definidas são formuladas com os elementosquimicamente puros extraídos de ingredientes disponíveis,tais como aminoácidos, açúcar específico, triglicérides quimicamentedefinidas, ácidos graxos essenciais, sais inorgânicos e vitaminas puras.Uso desse tipo de alimentação fornece o grau mais alto decontrole das concentrações de nutrientes da dieta. Entretanto, nemsempre são prontamente consumidas pelos roedores de laboratório eapresentam elevado custo para uso geral. As concentrações de nutrientesem dietas quimicamente definidas são teoricamente fixadas nahora da fabricação. Entretanto, a biodisponibilidade dos nutrientespode ser alterada pela oxidação ou interação de nutrientes duranteestocagem da dieta.

Os camundongos, ratos e hamsters apresentam crescimentocontínuo dos incisivos. As cobaias e lagomorfos apresentam crescimentocontínuo de todos os dentes (incisivos, pré-molares e molares),sendo, portanto, necessário o oferecimento de alimentos comgrau de dureza que estimule e provoque o desgaste dos dentes.

Entretanto, quando se trabalhar com animais mutantes oumodificados (AnGM), deve-se considerar a composição e o tipo deapresentação dos alimentos adequado ao comprometimento do animal.Há mutantes que apresentam ausência ou malformação dentária.Nestes casos, um alimento pulverizado ou gelatina nutritiva permitirácorrigir este inconveniente.

Mutantes portadores de distúrbios neurológicos ou muscularesgraves podem morrer devido à sua incapacidade de obter oalimento do comedouro ou a água da mamadeira. Recomenda-sedeixá-los a sós com uma mãe nutriz, além de colocar à disposição dosmesmos uma gelatina nutritiva ou um alimento pastoso com alto teorenergético durante as primeiras semanas de vida.

Em condições normais, alimentos não devem ser dispostossobre a forração da gaiola onde podem ser contaminados ou desperdiçados.Exceções são feitas à oferta de alimentos para animaisque, por qualquer motivo, não consigam acessar o local destinadopara a ração na gaiola de manutenção.

Os animais apresentam particularidades nas suas exigênciasnutricionais. As cobaias, por exemplo, são incapazes de sintetizar avitamina C (ácido ascórbico) em quantidade suficiente para satisfazeras suas necessidades diárias. Insuficiente ingestão de vitamina C podelevar à debilidade, aumento da susceptibilidade às doenças e, eventualmente,para o escorbuto. Portanto, para essa espécie, a vitamina Cdeve ser disponibilizada na ração, na forma de forragem ou suplementadana água de beber.

A dominância entre roedores é bem relatada. Portanto, quandoanimais são mantidos em grupos, deve-se tomar cuidado paragarantir que os subordinados tenham acesso suficiente à comida eágua. Quando necessário, deve-se manter mais de um ponto de acessopara o alimento e água, com distribuição dos comedouros e bebedourosnas gaiolas, a fim de permitir o acesso de todos do grupo ereduzir a possibilidade de competições e agressões. Quaisquer alteraçõessignificativas na ingestão de alimentos devem ser investigadas.O escore corporal dos animais é um bom indicador, fácil paracoletar e para interpretar, devendo fazer parte dos POPs para avaliaçãodo bem-estar dos animais. Animais com baixo escore corporalsinalizam algo de anormal e que deva ser investigado e rapidamentecorrigido, podendo se relacionar com a alimentação, doenças, estresse,etc.

Os comedouros devem permitir acesso fácil ao alimento,minimizar sua contaminação com a urina e fezes, garantindo a qualidadenutricional e sua boa condição.

Recomenda-se irradiar ou autoclavar alimentos utilizados emáreas controladas do ponto de vista sanitário. A autoclavação diminuia concentração de algumas vitaminas e antioxidantes. Portanto, asdietas autoclaváveis devem conter maiores concentrações de ingredientessusceptíveis ao calor para compensar as perdas induzidas pelaesterilização em autoclaves.

Outros itens de alimento, além da ração, podem ser oferecidosaos animais como grãos, vegetais e forragens. Entretanto, sódevem ser oferecidos após rigorosa higienização, pois podem representara entrada de algum tipo de contaminação, bem como interferirem algum procedimento utilizado nas atividades de ensino oupesquisa científica.

2.2.1.2. Estocagem dos alimentos

A ração deve ser armazenada em recintos, cobertos, ambienteslimpos, secos, arejados, sem odores e protegidos do sol e docalor, de modo a minimizar a deterioração e contaminação.

Dietas para animais devem ser utilizadas dentro do prazo devalidade estabelecido pelo fabricante e armazenadas em instalaçõescom as características já descritas. Dietas irradiadas, desde que mantidasnestas mesmas condições, apresentam um prazo de validademaior, mas sempre deve ser seguida a orientação do fabricante.

Os sacos de ração devem ser mantidos sobre estrados, depreferência de plástico, afastados da parede e armazenados de maneiraa facilitar a utilização dos mais antigos primeiro. O local destinadopara armazenar a ração não deve alojar outros insumos. Condiçãoprecária de armazenamento pode resultar em contaminação oumesmo perda de nutrientes, que pode não ser facilmente detectada.

Outros cuidados devem ser tomados em relação à aquisiçãodo alimento para os animais. Os responsáveis pela compra de raçãodevem ter conhecimento que não é benéfico submeter os animais avariações bruscas de alimento. Na hora de selecionar um fornecedorde ração, devem ser considerados os procedimentos de fabricação doproduto, seu transporte, bem como o controle de qualidade que garantao padrão final do alimento a ser adquirido.

2.2.1.3. Água

Água potável, fresca e limpa deve ser oferecida à vontade,exceto quando a proposta em estudo não permita. O monitoramentoda qualidade da água é um importante aspecto do programa de pesquisa,uma vez que a contaminação e composição química da águapodem afetar os resultados dos estudos com animais.

Métodos disponíveis para remover tanto agentes microbianosquanto contaminação química da água inclui: autoclavação, acidificação,cloração, osmose reversa, ultrafiltração, filtração e luz ultravioleta.Contudo, alguns destes métodos podem alterar a funçãoimunológica e a taxa de crescimento do modelo biológico utilizado.

O padrão mínimo para água dos animais deve ser água potável,ou seja, água que não ofereça riscos à saúde e que atenda aopadrão de potabilidade (Portaria Nº 2.914, de 12 de dezembro de2011/MS) deve estar disponível com livre acesso para todos os animais,exceto quando a proposta do estudo exija condição diferenciada. Entretanto,deve ter sido avaliado e aprovado pela CEUA da instituição.

Deve haver registro de fornecimento de água fresca aos animais,como também de higienização dos bebedouros e bicos de acordocom os POPs institucionais.

Os bebedouros devem permitir a observação da limpeza enível da água; suportar a esterilização e ter um formato de boca largapara permitir uma boa higienização. Os bebedouros devem ser sempresubstituídos por limpos e com água fresca e não completados. Ofornecimento de água aos animais quase sempre acompanha a mesmafrequência de troca das gaiolas. Não se recomenda completar a águadas mamadeiras, pois esta prática exige um controle muito rígido paraque não se cometa contaminação cruzada.

Bebedouros automáticos são equipamentos econômicos, mas,se não forem adequadamente projetados, são difíceis de ser desinfetadose podem promover contaminação cruzada.

2.2.2. Modificação da ingestão de alimento e água

Conforme já relatado, os animais devem ter acesso irrestritoe fácil a uma dieta nutricionalmente balanceada e água de qualidade.Em alguns protocolos de pesquisa, o valor nutricional da ração émodificado qualitativa ou quantitativamente; ou o período de acessoao alimento ou à água é alterado.

Compete a CEUA institucional avaliar cada um destes protocolose, mediante consistente justificativa científica, considerar pertinente,ou não, uma vez que estas condutas podem causar efeitosadversos à saúde e ao bem-estar dos animais.

2.2.2.1. Restrição alimentar

Animais se alimentam em busca de suas necessidades de energiae nutrientes e podem gastar boa parte do seu tempo comendo, casonão haja outros estímulos (enriquecedores ambientais) no seu ambiente.Porém, quando não há restrição de acesso, algumas espécies ou indivíduospodem comer além de suas necessidades fisiológicas. O acessoirrestrito ao alimento permite um desenvolvimento corporal normal,mas pode diminuir a longevidade, aumentar a incidência de doençasdegenerativas e neoplasia e, por vezes, aumentar o risco de obesidade.

O controle da disponibilidade de alimento para o animalpode ser simulada, tendo em conta a disponibilidade variável dealimento que ocorre na natureza. Como mencionado anteriormente, aredução da ingesta pode aumentar o tempo de vida e reduzir a incidênciade obesidade e algumas doenças nos animais. Por outro lado,a restrição calórica pode também estressar e reduzir a taxa de crescimentoem animais jovens e perda de peso corporal nos adultos.Estes problemas poderão ser mais acentuados se o alimento for debaixa qualidade nutricional ou desbalanceado. A restrição alimentar,em conjunto com outros fatores estressantes, pode estar associada àsulcerações gástricas em ratos e à morte em camundongos, sendo,portanto, motivo de sofrimento e baixos níveis de bem-estar. É importantelembrar que, ao calcular a quantidade de alimento que serádisponibilizada durante a restrição alimentar, deve-se considerar queem torno de 40% da quantidade de consumo diário, hídrico e alimentar,dos roedores é desperdiçada e não ingerida por eles.

Períodos de privação total de alimentos (jejum) podem prejudicara saúde e o bem-estar dos animais. A duração do jejumprecisa ser justificada em um contexto científico específico da espécie,condição fisiológica e de saúde dos animais envolvidos. Para ouso científico ou didático, portanto, qualquer período de privação dealimento proposto para o animal deve ser avaliado cuidadosamente,quando submetido à apreciação da CEUA.

2.2.2.2. Restrição de líquidos

A ingestão de líquidos é influenciada pela sede, tipo de dieta,disponibilidade de líquido entre outros. A restrição de líquidos podeaumentar o risco de desidratação e ingestão reduzida de alimentos.Uma redução aguda de ingestão hídrica pode resultar em rápida perdade mais de 15% de peso corpóreo, sede, secura das membranas damucosa, produção reduzida de urina, redução de consumo alimentar,perda da elasticidade da pele, letargia, choque e colapso cardiovascular.A desidratação é uma complicação comum que pode não serreconhecida facilmente em seu estágio inicial sem um monitoramentocuidadoso e funcionários capacitados.

Alguns estudos restringem a ingestão de líquidos antes daanestesia ou transporte. Da mesma forma mencionada para privaçãode alimento, a privação hídrica precisa ser determinada dentro de umcontexto científico específico, de acordo com a espécie, o estadofisiológico e de saúde do animal envolvido, o que não se justificariapara o uso do procedimento no ensino. Para o uso científico oudidático, o procedimento deve ser avaliado cuidadosamente pelaCEUA.

Estratégias de controle de dor e distresse devem ser utilizadasquando a disponibilidade de ração ou a água forem alteradasem animais. Estas estratégias incluem o controle da desidratação,diminuição de crescimento e perda de peso. Se estas observações nãofizerem parte da proposta do estudo, medidas de controle e prevençãodevem ser adotadas.

2.2.2.3. Modificação de comportamento alimentar ou hídrico

Alimentoou líquido pode ser usado como recompensa, mesmopara animais bem alimentados. Muitas vezes, entretanto, os animaisprecisam estar com fome ou sede para trabalhar ou realizar umatarefa para receber alimento ou água como recompensa. Em todos oscasos onde o pesquisador possa causar impacto sobre a ingestão deágua e alimento, uma justificativa científica, circunstanciada, deve serfornecida à CEUA, para submeter o protocolo à aprovação. O procedimentonão se aplicaria ao uso no ensino, apenas ao uso científico.

2.2.3.Manejo

O manejo dos animais em instalações destinadas à produçãode roedores e lagomorfos deve ser descrito em procedimentos clarose acessíveis a todos os funcionários que lidam com a produção. Sãovárias as atividades ligadas diretamente à produção e manejo, apesarde serem comuns a todas as espécies (camundongo, cobaia, coelho,hamster e rato), são realizadas em intervalos diferenciados, obedecendoao ciclo biológico e comportamento específico de cada espécie.Fundamentalmente, em uma produção, temos as principais atividades:acasalamento, desmame, sexagem, reposição de reprodutores e a trocadas gaiolas. É imprescindível que todas as atividades de produçãoestejam estabelecidas em POPs, descritas de forma clara e com suasfrequências definidas. Também é desejável o registro das atividades.

Conhecer profundamente as espécies que se está manejandoé fundamental para um bom manejo e manutenção de bons níveis debem-estar animal. Os funcionários devem conhecer o comportamentoe biologia dos animais para minimizar as situações de estresse epromover situações que gerem estímulos prazerosos. O manejo etológicoé o que leva em consideração o comportamento dos animais,sua biologia e o controle de elementos estressores, para desempenharas atividades ou manejo necessário com os animais, e deve ser aplicadoem todas as formas de manipulação e manejo.

O quadro a seguir apresenta a idade mais usual para acasalamentoe desmame de camundongo, cobaia, coelho, hamster erato.

*Camundongo Swiss; **Cobaia Inglesa; *** Coelho New Zealand

White; **** Hamster Sírio; *****Rato Wistar, todos heterogênicos.

O padrão genético do animal pode alterar os parâmetrosapresentados para peso e idade de acasalamento e desmame. Animaisisogênicos (inbred), mutantes ou modificados, podem necessitar decondições diferenciadas de manejo. No manejo mais usual de isogênicos,já ao desmame, formam-se os casais entre irmão, com o

objetivo de facilitar o manejo e minimizar espaço e quantidade degaiolas. Entretanto, há instituições que definem o manejo de desmamede isogênicos da mesma forma dos heterogênicos (outbred) e posteriormentejuntando-os para o acasalamento. Esta prática exige maiscuidados com os dados das fichas para evitar possíveis perdas dedados.

Animais que apresentem distúrbios que acarretem limitaçõesde aleitamento devem contar com a ajuda de outra nutriz, comoferramenta de manejo, que garanta a sobrevivência da ninhada.

No desmame também ocorrem algumas particularidades, dependendoda espécie, ou mesmo da característica da linhagem.

Adotou-se dizer que o desmame ocorre aos 21 dias de idade,para ratos e camundongos, em sistemas intensivos. Esta afirmação setorna obrigatória quando a fêmea que aleita vai parir uma novaninhada e a ninhada anterior permanece na gaiola. Não deve seraceito duas ninhadas da mesma fêmea na mesma gaiola.

Isso não se aplica para todas as espécies. No caso de cobaias,o desmame ocorre quase sempre pelo parâmetro do peso, essa espécienasce com uma maturidade diferente das demais (camundongo, rato,coelho e hamster), ou seja, nasce com pelos, olhos abertos, andam eapresentam dentes aptos a roer imediatamente ao parto. Portanto, 21dias de idade, torna-se um período muito longo.

No momento do desmame, os animais heterogênicos ou animaisisogênicos, que serão destinados diretamente aos usuários, devemser separados por sexo (sexagem), alojados em gaiolas distintas(machos e fêmeas), identificadas e acomodadas nas salas ou estantesde estoque de animais, onde são mantidos, aguardando sua utilização.Existem algumas particularidades, como quando os animais são destinadosaos usuários antes do desmame, como nos casos de fornecimentode recém-nascidos para alimentação de outros animais oupara inoculação de amostras biológicas provenientes de animais silvestrescom suspeita de serem portadores e/ou transmissores de vírus.Nesse caso, os animais lactentes são acompanhados de suas mães.

Cuidado especial deve ser dado ao fornecimento de animalque não consegue se alimentar sozinho, ou seja, na condição delactente. Quando do fornecimento de animais lactentes desacompanhadosde suas mães, o usuário deve estar preparado para receber oslactentes e imediatamente proceder a utilização dos mesmos.

Acasalamento é uma atividade frequentemente realizada nasinstalações destinadas à produção de animais, sua realização requerum conhecimento prévio do padrão genético do animal a ser acasalado,da necessidade de reposição de reprodutores e da demanda deanimais fornecido aos usuários.

O acasalamento de colônias de animais outbred deve seguiresquemas que evitem o cruzamento de indivíduos aparentados, comoo esquema rotacional de Poiley ou Han rotacional. Essas colôniasdevem ser grandes o suficiente (mais de 100 casais ou unidadesreprodutivas poligâmicas) para assegurar por muitos anos a heterozigosegenética dos animais. Colônias pequenas devem utilizar métodosespecíficos de acasalamentos que garantam menos de 1% deconsanguinidade. Mesmo nas grandes colônias essa preocupação deveexistir com o passar de muitos anos.

O acasalamento de animais isogênicos acontece entre irmãos.Quando suas progênies F1 forem usadas, é importante monitorarperiodicamente a autenticidade genética.

Acasalamentos de animais geneticamente modificados(AnGM), requerem condições especiais de manejo de suas populações.Estratégias de reprodução cuidadosamente desenhada e assessoramentogenotípico devem ocorrer sempre, com o objetivo deminimizar a possibilidade de animais com genótipos indesejáveis. Otrabalho com AnGM requer autorização da Comissão Técnica Nacionalde Biossegurança (CTNBio).

Os acasalamentos podem ser monogâmico, 1 macho para 1fêmea (1:1), poligâmico 1 macho para duas fêmeas(1:2), ou mais,sempre respeitando-se as recomendações de espaço. No caso de produçãode cobaias, é muito usual o sistema de harém 1 macho para até5 fêmeas, o que não é considerado errado, desde que o espaço dedicadoa esse arranjo esteja dentro do estabelecido no Capítulo "EstruturaFísica e Ambientes para Roedores e Lagomorfos".

Para cobaia, utiliza-se: o método Poiley, sistema poligâmico,harém intensivo (1 macho para 5 fêmeas), respeitando-se o espaçorecomendado para a espécie.

Para coelhos, aplica-se o método Poiley, sistema poligâmicotemporário. Nessa espécie, o pareamento dos animais só ocorre paraa cópula, quando a fêmea deve ser levada à gaiola do macho e apósa cópula, removida para a sua gaiola. A proporção de machos parafêmeas deve ser mantida em torno de 1 macho para 5 fêmeas, porém,os animais são mantidos separados.

Hamsters são acasalados quase sempre em sistemas monogâmicosintensivos, devido ao comportamento mais agressivo dessasfêmeas a poligamia não apresenta bons resultados no caso de animaisoutbred. Há relatos de sucesso usando poligamia com hamster inbred,mas mesmo nas linhagens com fêmeas menos agressivas, faz-se necessárioa separação do macho quando da certificação da preenhez esua volta no momento do desmame dos filhotes.

2.2.3.1. Identificação

Os registros dos animais devem constar nas etiquetas, (cartões,fichas) fixados na gaiola. Entretanto, outro tipo de registro,como livros ou planilhas computadorizadas, sempre atualizadas, queresumam a disponibilidade de animais na instalação de produção, érequerido. O segundo registro é importante devido à constante manipulaçãodas gaiolas e fragilidade das etiquetas, que pode acarretarna perda das informações. Nas fichas das gaiolas dos reprodutores,devem constar dados como: espécie, linhagem, data de nascimento,dados dos pais, sexo, data do acasalamento, data dos partos, númerosde nascidos, números de mortos, data de desmame e quantidade defilhotes desmamados. Animais em salas de estoque (manutenção)também necessitam de fichas com os dados de data de desmame, salade origem, sexo e quantidade de animais por gaiola. Quando dorecebimento dos animais pelos usuários, mais dados podem ser acres-

cidos à ficha dos animais, como: data de recebimento, nome dopesquisador responsável pelo animal, número do protocolo que requisitou,entre outros.

Além das fichas nas gaiolas, pode-se ter vários outros tiposde informações individuais dos animais, que são importantes para agestão da instalação de produção, tais como: identificação do genótipo,para acompanhar cruzamentos, dados sobre a saúde animal,registros médicos e dados de pesquisa.

Existem vários métodos disponíveis para a identificação deroedores, incluindo furos na orelha, brincos, tatuagens, marcação comtinta, microchips subcutâneos. Todos os métodos têm vantagens edesvantagens, a escolha do método depende do nível de exigência daproposta de estudo, da viabilidade financeira e do animal a ser identificadoe da aprovação da CEUA institucional. Entretanto, métodoscomo furo na orelha e tatuagem devem ser realizados em animaiscom até três semanas de idade, sem anestesia e, posterior a isto,apenas com o animal anestesiado. Quando o procedimento de genotipagemestiver estabelecido, o tecido resultante da perfuração daorelha deve ser usado para esse fim. Para marcação com tinta, deveser usado tinta atóxica e sem cheiro.

2.2.4. Troca

Assim denomina-se a atividade de transferência dos animaisde uma gaiola onde estavam (gaiola suja) para nova gaiola (gaiolalimpa). Esta tarefa não deve ser um ato mecânico e, sim, um momentopara aplicação do manejo etológico e de observação do animal,uma vez que é na troca que se percebe alterações no estado de saúdedo animal (Olsson et al., 2003).

A frequência da troca é uma consequência da estrutura físicada instalação onde estão mantidos os animais, do material oferecidopara cama, número de animais na gaiola e estado fisiológico dessesanimais. Em gaiolas abertas com uma boa renovação de ar (10 a 20trocas de ar por hora), em sistemas de acasalamentos poligâmicos,pode ser realizado duas trocas por semana; nos microisoladores, comanimais em acasalamentos monogâmicos e bom material de cama, afrequência pode chegar de 10 a 14 dias sem troca. Tudo depende dacapacidade do sistema de trocas de ar de cada equipamento, mas oobjetivo é um só: diminuir o teor de amônia dentro das gaiolas dosanimais e a manutenção do bem-estar. Animais diabéticos ou comoutras alterações fisiológicas específicas podem requerer frequênciade trocas especiais.

Chamamos de cama ou forração o material usado para forraro interior das gaiolas. Este insumo é de extrema importância, devidoà sua proximidade com os animais. No Brasil, o produto mais usadopara forração é a maravalha (produto resultante da raspa de madeira),mas existe um subproduto do sabugo de milho, que reduz o acúmulode amônia no interior das gaiolas. Como regra geral, a forração deveser macia, absorvente, atóxica e inodora. Recomenda-se a esterilizaçãoda forração, seja por autoclavação, seja por irradiação.

O critério para estabelecer a quantidade de forração colocadaem cada gaiola deve ser que essa seja suficiente para absorver osexcrementos eliminados pelos animais no período entre as trocas,com o cuidado de não interferir na movimentação dos animais nagaiola, mas permitir que desenvolvam tipos específicos de comportamento,como esconder-se e confeccionar ninho.

O fornecimento de verde (capim, feno, hortaliça, etc.) é bemvisto, como item de enriquecimento alimentar ou como fonte dealimento, sendo mais usual em áreas de produção de coelhos e cobaias.Esse tipo de fornecimento requer um difícil processo de desinfecçãoque deve ser descrito em POP.

Programas de enriquecimento ambiental devem ser bem elaborados,considerando a biologia do animal, o espaço físico disponívelna gaiola e permitir uma higienização, seja química ou porautoclavação. Seu fornecimento pode acompanhar a troca das gaiolas.

2.2.5.Área de higienização

Na área de higienização, também chamada área de lavagem,"pulsa o coração da instalação de produção", pela característica deseus procedimentos, é a área mais sujeita a pressões, e, se tudo ocorrenas condições previstas, grande parte dos problemas está resolvido.

As gaiolas e os bebedouros trocados na área de produção sãoenviados para essa área, onde devem seguir uma sequência de processosaté o seu retorno à área dos animais. Portanto, é imprescindívelque esse espaço esteja separado, isolado e o mais distantepossível das salas de animais.

Um programa de higienização deve ser estabelecido com oobjetivo de reduzir ou eliminar as formas vegetativas de bactériaspatogênicas e oportunistas, bem como outros organismos que possamser controlados antes da esterilização. A lavagem é mais efetivaquando realizada com água aquecida com temperatura entre 75 a 85oC, acompanhada de produtos químicos, que atendam essa finalidade.

Nalavagem manual deve ser atribuída atenção especial àsetapas de molho e enxague, etapas que podem interferir diretamenteno bem-estar animal. A etapa de molho requer uma diluição e umtempo de ação do produto adequados, que devem seguir a orientaçãodo fabricante. A etapa de enxágue deve ser bem realizada para evitara presença de resíduos do produto químico utilizado.

O ideal é a lavagem em máquinas que têm auto dosador, ouseja, regula a quantidade de sanitizante de acordo com a quantidadede água utilizada. Após o processo de lavagem e desinfecção, osrecintos primários (gaiolas) devem ser esterilizados, de preferência,em autoclaves e esses devem ser certificados para garantir segurança.

Apósa lavagem dos utensílios, eles devem ficar sobre estradosplásticos para que escorram o excesso de água e, posteriormente, devemser levados às autoclaves para serem esterilizados. Para remoção de algumasujeira depositada nos bicos, usa-se o ultrassom, ou método mecânicoque seja efetivo. Tanto os bicos quanto as rolhas devem ser lavadose esterilizados por autolavagem, antes de retornarem aos animais.

Independentemente do processo de higienização ser automáticoou manual, é imprescindível que sua eficácia seja testada.Quando automatizado, deve ocorrer a validação do processo de higienizaçãoe a certificação do equipamento, de acordo com instruçõesdo fabricante ou da Garantia da Qualidade envolvida no processo.Quando manual, deve ser realizado monitoramento por meio de culturamicrobiológica ou ainda por meio de sistemas de detecção dematerial orgânico.

Limpeza e desinfecção do ambiente secundário (salas e espaçosde apoio) devem seguir um planejamento de limpeza para todasas áreas da instalação, ou seja, um procedimento onde se descrevecomo será realizada a limpeza, seu fluxo, frequência, tipos de produtosque serão usados, entre outros detalhes inerentes à particularidadeda atividade exercida.

A frequência de limpeza, como já mencionado no item troca,também será uma consequência da estrutura física, sistema de ar,material oferecido para cama, número de animais na gaiola, estadofisiológico desses animais e imposições do projeto científico.

Todas estas atividades devem constar nos Manuais de procedimento,POPs, descrevendo o passo a passo e serem registradasem seus respectivos protocolos, concluindo, desta forma, o ciclo deatividades necessárias à produção de animais de laboratório e permitindoa rastreabilidade de todo processo.

2.2.6. Segurança do Operador

Os operadores que realizam as múltiplas atividades descritasneste Capítulo devem usar Equipamento de Proteção Individual (EPI)adequado ao desempenho da atividade, bem como, quando necessário,o ambiente deve contemplar Equipamentos de Proteção Coletiva(EPC). O responsável pela unidade, de acordo com o PPRA(Programa de Prevenção de Riscos Ambientais - NR 9/MT ou outraque a substitua), deve requerer ao diretor institucional os EPIs e EPCsadequados a cada atividade. Esses equipamentos de proteção devemconstar no respectivo POP de cada atividade ou no manual de procedimento.Salientamos que todos os operadores devem estar comcarteira de imunização atualizada, conforme determinado pelo PCMSO(Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional (NR 7/MTou outra que a substitua) e PPRA.

2.2.7. Descarte de Materiais

Os resíduos são classificados em função dos riscos potenciaisao meio ambiente e à saúde, como também da sua natureza e origem(ABNT NBR 10.004/2004 ou outra que a venha substituir). Os resíduosainda são classificados em função de suas características específicas,cujo manejo demanda cuidados e métodos especiais decoleta, transporte e destinação final. Nesse grupo, estão compreendidosos Resíduos de Serviço e Saúde (RSS), os quais são resultantesde atividades exercidas nas atividades relacionadas com o atendimentoà saúde humana ou animal, assim como estabelecimentos deensino e pesquisa na área de saúde, entre outros (RDC 306 ANVISA,2004 ou outra que a venha substituir). Portanto, todo estabelecimentoque gera RSS deve elaborar um Plano de Gerenciamento de Resíduosde Serviços de Saúde - PGRSS, baseado nas características dos resíduosgerados e na classificação constante do Apêndice I (RDC 306ANVISA, 2004 ou outra que a venha substituir), obedecendo diretrizesde manejo dos RSS. O PGRSS a ser elaborado deve sercompatível com as normas locais relativas à coleta, transporte edisposição final dos resíduos gerados nos serviços de saúde, estabelecidaspelos órgãos locais responsáveis por estas etapas (RDC306 ANVISA, 2004 ou outra que a venha substituir).

2.2.8. Cuidados de Fins de Semana e feriados

Deve haver uma programação definida para cuidados dosanimais nos fins de semana e feriados, com escala dos funcionários,uma vez que os animais devem receber o tratamento devido diariamente.Planos de contingência e de emergência compatível com onível de atividade da unidade são imprescindíveis. Devem ser previstassituações, como falta de energia elétrica, falta de água fundamentalmentepara bebedouros automáticos e situações não previstas,como atentados e invasões. Telefones de contatos dos médicosveterinários, dos responsáveis pela unidade devem constar nas instalações,como também no departamento de segurança da instituição.

III- PROCEDIMENTOS DE COLETA DE FLUÍDOS CORPORAIS,SECREÇÕES E EXCREÇÕES.

Neste tópico, apresentamos as principais atividades realizadasnos projetos de pesquisas as quais devem acontecer em ambientediferente das áreas de produção de animais, como consta noCapítulo "Estrutura Física e Ambientes para Roedores e Lagomorfos".

Amostrasbiológicas (fluidos corporais, secreções e excreções)são coletadas do animal para análise de alterações bioquímicas,metabólicas, toxicológicas, imunológicas e fisiológicas. A coleta desangue é uma ferramenta científica valiosa que permite o monitoramento,de uma forma dinâmica, de diversos eventos biológicos.Seja qual for a amostra a ser coletada, deve-se levar em conta omanejo etológico para o uso da imobilização adequada, para diminuiro tempo de contenção, de coleta e de estresse. O ideal é que aamostra seja colhida de forma asséptica e todo cuidado deve sertomado para evitar a contaminação cruzada de amostras.

3.1 Procedimentos de coleta:

3.1.1 Urina

A análise da urina permite o monitoramento da presença,ausência e concentração de drogas e outras substâncias excretadas.Essa análise pode ser quantitativa ou qualitativa. A análise quantitativade urina permite o monitoramento de pH urinário, proteína,glicose, bilirrubina, hemoglobina, cetona, urobilinogênio, creatinina ea concentração de drogas excretadas, metabólitos e outras substâncias.A análise qualitativa de urina é geralmente usada para monitorarfunção renal, doença renal, avaliação de anormalidades nutricionaise/ou endócrinas e a excreção de drogas e/ou metabólitos.

A urina pode ser coletada de diversas formas: micção doanimal consciente; via catéter urinário, mediante anestesia geral, cistocentese,com o uso de gaiola metabólica, entre outras.

3.1.2. Secreção nasal

Secreções nasais e amostras da conjuntiva são geralmentecoletadas para análise de agentes bacterianos ou outros agentes infecciosos.As amostras devem ser colhidas com um swab estérilumedecido, mantidas sob refrigeração e analisadas prontamente. Dependendoda espécie, anestesia leve pode ser necessária, ao colhersecreções nasais, para minimizar o desconforto do animal e para obteramostra não contaminada.

3.1.3. Secreção ocular

Amostras conjuntivais devem ser colhidas com um algodãoestéril, gaze ou cotonete de dracon, umedecido. O cotonete deve sersempre manuseado de forma estéril, mantido em meio de cultura,refrigerado e enviado para o laboratório sem demora.

3.1.4. Material bucal

Amostras de saliva podem ser utilizadas em estudos do sistemaimune secretor e do sistema digestivo, para medir cortisol deforma relativamente não invasiva e para detectar sinais de doençainfecciosa. Raspagens da mucosa oral são utilizadas como uma fontede DNA e em estudos virológicos. Dependendo da espécie, a coletade saliva mista da cavidade oral pode ser simples e não invasiva.Anestesia leve pode ser necessária em alguns casos, por exemplo,quando o animal não consiga ser contido adequadamente.

3.1.5. Leite

Amostras de leite são colhidas após a limpeza e secagemda(s) teta(s), evitando-se o uso de antissépticos. As primeiras gotas deleite devem ser descartadas antes que a amostra seja coletada.

3.1.6. Fezes

Exames de fezes podem ser qualitativos ou quantitativos.Pequenos volumes são necessários para estudos qualitativos e sãocoletados do piso da gaiola ou diretamente do reto no animal imobilizado.Estudos quantitativos requerem que todas as fezes sejamcoletadas ao longo de um período de tempo determinado (normalmente24 horas). Uma gaiola metabólica é o método usual.

3.1.7. Secreção do trato genital

Amostras de secreções vaginais devem ser retiradas comuma gaze de algodão, um cotonete de algodão ou lavado vaginal, demodo estéril, e aplicado suavemente na região vaginal, para minimizardesconforto ao animal. Amostras para identificação da fasedo ciclo estral são examinadas sob o microscópio imediatamente.Atenção especial deve ser dada ao tamanho da fêmea, o cotoneteutilizado para colete deve ter uma relação proporcional à dimensão docanal vaginal da fêmea que será usada.

3.1.8. Sêmen

Os métodos de coleta de sêmen incluem monta natural ecoleta na fêmea, eletroejaculação sob anestesia e coleta após eutanásia.Os métodos são espécie-específicos e causam estresse emmuitas espécies.

3.1.9. Sangue

Sangue é coletado de um animal para análise e monitoramentocuidadoso de padrões bioquímicos, metabólicos, toxicológicos,imunológicos e fisiológicos. Orientações para a coleta segurade sangue devem considerar o fato de que todas as espécies têm amesma relação entre volume de sanguíneo e peso corporal. Animaisjovens, idosos, estressados, portadores de doença cardíaca ou respiratóriaou mesmo submetidos a manipulações exigem cuidadosomonitoramento, pois são mais sensíveis à perda de sangue. A técnicade contenção do animal e o procedimento de coleta podem alteraralguns padrões bioquímicos do sangue devido ao estresse. É importantehabituar o animal ao executor do procedimento e ao procedimentoantes de sua realização. Isto pode reduzir o estresse envolvidoe gerar resultados mais precisos. O treinamento do executor éfundamental para o sucesso do procedimento e faz parte do refinamentoproposto pelo Princípio dos 3R's.

O volume de sangue circulante pode geralmente ser estimadoem média como 55-70 mL/Kg do peso corpóreo em animais saudáveisou 6-8% do peso corpóreo. Animais velhos e obesos podem teruma redução de 15% no volume de sangue circulante.

O volume máximo recomendado para coleta de sangue é de10% do volume de sangue circulante em animais saudáveis e bemnutridos, observando um período mínimo de recuperação de 3-4 semanas.A remoção de volumes maiores de sangue é perigosa para asaúde do animal. A remoção de 15% a 20% do volume do sangueinduz redução do débito cardíaco e da pressão sanguínea. A remoçãode 30-40% pode induzir choque hipovolêmico e morte. Para coletasrepetidas, pode ser removido o volume máximo de 1% do sanguecirculante do animal, a cada 24 horas.

3.2 Considerações gerais para minimizar os efeitos adversosda coleta de fluidos corporais, secreções e excreções para orientar aseleção dos métodos:

Quando amostras forem retiradas de um animal consciente eo procedimento de amostragem for repetido regularmente duranteuma pesquisa, o animal deve primeiramente ser aclimatado ao instrumentode imobilização (ex.: por meio de execuções simuladas).

Uma equipe treinada adequadamente, utilizando métodos quegerem o mínimo de dor, deve realizar a coleta de amostras biológicas.

Quantomais rápido o procedimento for realizado no animalconsciente, melhor será a qualidade das amostras, porque as alteraçõesfisiológicas induzidas por estresse são minimizadas.

A utilização de sistema de recompensa ao coletar amostras deum animal consciente deve ser considerada. Quando o procedimentode amostragem for repetido regularmente durante uma pesquisa, osistema de recompensa pode favorecer uma associação positiva.

O treinamento do executor é fundamental para o sucesso de todos osprocedimentos e faz parte do refinamento proposto pelo Principio dos 3R's.

Importante a aplicação do manejo etológico para todos osprocedimentos de manuseio dos animais.

É importante manter a assepsia ao longo da coleta e osprodutos utilizados para a assepsia devem ser subsequentemente removidospara evitar a contaminação da amostra. Aplicação tópica decremes anestésicos, quando apropriada, aliviará significativamentequalquer desconforto associado à punção venosa.

Os pesquisadores devem, antes de imobilizar o animal, preparartodos os equipamentos e materiais necessários para diminuir aomáximo o tempo de contenção.

3.3. Considerações importantes para a coleta de sangue:

O executor da coleta deve ter capacitação adequada pararealizar a atividade naquele animal;

Não se deve puncionar um sítio que apresente inflamação ouhematoma;

Sempre que possível, deve-se usar técnicas de canulaçãopara coleta de amostras múltiplas.

Locais de coleta de sangue e recomendações para roedores ecoelho estão descritos na Tabela1 A.

O método, volume e frequência da coleta devem tambémlevar em consideração fatores associados ao bem-estar do animal. Asprincipais consequências da coleta de sangue que podem afetar obem-estar do animal são: perda excessiva de sangue, trombose, hematomase inflamação do vaso.

Os efeitos da perda crônica de sangue são mais discretos queaqueles oriundos da perda de sangue aguda. Esses sinais incluempalidez das mucosas, atividade reduzida, aumento na frequência respiratóriae presença de extremidades frias. A perda da massa musculare diminuição do peso corporal também são observados noscasos de perdas crônicas.

Pequenos volumes removidos frequentemente podem causaranemia. Sempre quando possível, é recomendada a reposição de fluidosapós coletas de sangue. O recomentado é a reposição de duasvezes o volume retirado por fluidos isotônicos, preferencialmentesolução Ringer Lactato.

O aquecimento suave da cauda de camundongos e ratos(recomenda-se envolver a cauda com algodão embebido em águaaquecida ou mergulhada em recipiente com água na temperatura adequada),reduzirá o tempo de retirada do sangue e consequentemente oestresse associado. Entretanto, uma imobilização inadequada prolongaráo tempo de retirada de amostras, aumentará os riscos para oanimal e reduzirá a qualidade das mesmas.

Quando coletas múltiplas são necessárias, deve-se alternar olocal da coleta.

IV- VIAS DE ADMINISTRAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

Descrever todas as vias de administração está além do escopodeste documento. Portanto, a ênfase é dada na descrição dosprocedimentos mais usuais e aos seus refinamentos.

O procedimento de administração de substâncias pode causarimpacto no bem-estar do animal e na validade dos resultados. Aexperiência, o treinamento, a habilidade da pessoa que administra aaclimatação e o treinamento são aspectos de refinamento que devemser considerados durante o planejamento de um projeto científico oudidático.

A via escolhida na administração de substâncias testes estabelecerálimites no volume a ser administrado e influenciará na suabiodisponibilidade. As exigências do estudo e o risco potencial aosanimais serão fatores-chave na seleção da via.

Treinamento é um pré-requisito fundamental para realizaçãode procedimentos de administração de substancias. O pessoal querealiza esses procedimentos deve ser experiente e capacitado.

As vias de administração mais utilizadas são descritas aseguir.

4.1. Principais vias de administração de substâncias

4.1.1. Via oral (VO)

Respeitadas as propriedades físicas e químicas, as substânciaspodem ser administradas pela água de beber, no alimento ouatravés da administração orogástrica (gavagem), na qual a substânciaé introduzida pela boca e depositada diretamente no estômago.

A gavagem permite a administração da dosagem exata. Umasonda flexível de polietileno, ou uma cânula rígida de aço inoxidávelcom extremidade arredondada, é cuidadosamente introduzida na bocado animal, passando pelo esôfago e chegando ao estômago, onde omaterial é dispensado.

A gavagem é o método mais preciso dentre os procedimentospor administração oral. Porém, poderá representar um risco para obem-estar do animal, por ser mais invasivo. Neste método, o volumeda substância que pode ser administrado com segurança, bem comoas dimensões do aparato de gavagem, depende do tamanho do animal.Como referência, o volume máximo dado por gavagem é 10 mL/kgde peso corpóreo.

A administração pela água de beber ou no alimento deve serfeita com acompanhamento da ingestão desses. É possível que asubstância a ser administrada modifique as propriedades organolépticas,levando à alteração no padrão de consumo de água ou ração eimpactar negativamente o bem-estar animal e/ou o resultado.

4.1.2. Via intravenosa (IV)

É a via em que há a introdução da medicação diretamente nacorrente sanguínea e que permite a mais rápida ação do fármacoadministrado. Nas espécies em que as veias podem ser acessadasatravés da pele (percutaneamente), deve ser utilizado um anestésicolocal, como um creme, aplicado na pele no local proposto. De acordocom as características das substâncias, elas podem ser administradasrápida ou lentamente. Nas administrações de substâncias e seus veículospor via parenteral, devem ser considerados os seguintes fatores:o volume usado, a estabilidade da formulação, pH, viscosidade, osmolaridade,capacidade de tamponamento, esterilidade e biocompatibilidadeda formulação. Devem ser usados tamanhos e calibres deagulhas compatíveis com a espécie animal, considerando-se o calibredo vaso sanguíneo e a velocidade da injeção.

4.1.3. Via intraperitoneal (IP)

A via intraperitoneal é comumente usada em ratos e camundongos,mas pode ser utilizada em outras espécies. Não é necessáriaanestesia e a injeção é feita no quadrante abdominal inferiordo lado direito do animal. Embora injeções IP pareçam seguras, hárisco em puncionar o trato intestinal por dificuldade de contenção doanimal. Não são indicadas para múltiplas doses e materiais irritantespodem causar peritonite.

4.1.4. Via subcutânea (SC)

A via subcutânea é comumente usada em todas as espécies.As soluções devem ter pH fisiológico e ser isotônicas. As injeçõessão feitas normalmente no dorso, na nuca ou flanco. O animal nãonecessita ser anestesiado. A absorção dessa via é lenta, especialmentepara soluções oleosas. Nas administrações de doses múltiplas, recomenda-sea alternância do local de administração.

4.1.5. Via Intramuscular (IM)

O sítio mais utilizado nesta via é o músculo bíceps femoralda coxa. Entretanto, a escolha deve considerar a possibilidade dedano às terminações nervosas. A absorção desta via é lenta. Paraestudos com múltiplas doses, recomenda-se fazer uma rotação dossítios. A administração intramuscular pode ser dolorosa porque asfibras estão obrigatoriamente sob a tensão do material injetado.

Outras vias de administração também podem ser acessadas,tais como intra-auricular, transdérmica, intradérmica, intratecal e intraocular.Quando necessária administração contínua de substâncias,pode ser feita utilizando-se implante subcutâneo, minibomba osmóticaou cateter venoso de permanência.

Tabela 1B - Métodos e vias comuns de administração desubstâncias nos roedores e lagomorfos (sítio de administração, máximode volume aceito e tamanho da agulha)

4.2 Cuidados a serem considerados para administração desubstâncias em animais:

A substância e seu solvente líquido devem ser apropriadospara a via de administração, a espécie e a finalidade científica. Soluçõespara injeções devem ter pH próximo de 7,0 para reduzir orisco de dano ao tecido. A ordem de tolerância para uma substânciacom um pH na faixa entre 4,5 e 8 é: oral>IV>IM>SC. A substânciadeve ser solúvel em solventes biocompatíveis padronizados. Atençãodeve ser dada aos tamanhos e calibres de agulhas que devem sercompatíveis com a espécie animal.

A aclimatação ao novo ambiente e treinamento para o procedimentode administração pode minimizar o distresse no animal.Esse procedimento deve ser adotado especialmente quando animaisque não estão acostumados ao manuseio devem receber substânciasem mais de uma ocasião. Quando possível, recompensas (reforçopositivo) devem ser utilizadas ao treinar os animais para cooperaremcom o procedimento. Após receberem a dose, os animais devem sermonitorados para verificar efeitos adversos, dor e distresse.

Contaminação e infecção podem resultar da administração desubstâncias indevidamente manipuladas: uso de agulhas e seringasnão estéreis, transferência de infecção entre animais por uso comumde equipamentos ou introdução de micro-organismos ao perfurar apele. A necessidade de preparação da pele deve ser avaliada para cadacaso específico. A antissepsia da pele pode envolver o corte do peloe uso de uma solução antisséptica. Em casos de inoculação de agentesinfecciosos, proceder à antissepsia antes e após a inoculação.

Na administração por injeção, identificado o sítio de aplicação,a agulha deve ser inserida firmemente na posição correta e naprofundidade exigida.

A lista de sinais de dor e distresse, específica da espécie,deve ser consultada no checklist de monitoramento previamente elaborado.Na Tabela 2, encontram-se os procedimentos para minimizara dor e o distresse ao administrar substâncias.

V - Estudos fetais e embrionários

Estudos fetais e embrionários são amplamente utilizados paraconhecer a fisiologia embrionária, fetal e neonatal, bem como paravalidar técnicas de correção de anormalidades fetais em humanos. Oconhecimento adquirido da pesquisa fetal e embrionária é utilizadopara melhorar a sobrevivência, saúde e bem-estar de animais recémnascidos,bem como para a melhor compreensão da biologia do desenvolvimento.Para estudos com embriões, é necessária sua coleta deuma mãe gestante ou pelo desenvolvimento de embriões, utilizandotécnicas de fertilização in vitro.

O acesso ao feto pode ser feito diretamente via uma incisãoabdominal na mãe devidamente anestesiada, com a exposição de parteou de todo o feto por meio de incisões na parede uterina. O acessotambém pode ser realizado indiretamente, utilizando-se técnicas demonitoramento como ultrassom ou procedimentos radiológicos, e portécnicas laparoscópicas, estas ultimas também necessitando de anestesia.

Osestudos podem envolver coleta de amostras do feto, dosanexos fetais ou do útero, além da colocação de cateteres ou instrumentosno feto ou placenta. Todos esses procedimentos exigemanestesia materna, caso não seja in vitro.

Independentemente das circunstâncias, esse tipo de procedimentorequer apresentação de justificativa robusta pelo pesquisadorresponsável e criteriosa análise pela CEUA da instituição, pois obem-estar do feto e da mãe deve ser considerado quando animais emgestação forem submetidos à cirurgia ou a outras intervenções.

Laparotomia com cirurgia uterina causa dor significativa namãe e pode expor o feto a um estímulo potencialmente nocivo quedeve ser levado em consideração no planejamento do procedimento.

5.1. Técnicas laparoscópicas - Dor ou distresse maternal

Deve-se assumir que tais procedimentos causarão dor emanimais. Qualquer animal que passe por uma laparoscopia deve recebermedicação analgésica apropriada para obter uma boa imobilizaçãodurante o procedimento e evitar a dor.

5.2. Dor e perturbação fetal

Deve se avaliar o estágio de desenvolvimento do animal e oseu nível de senciência. Intervenção cirúrgica no feto poderá causarestímulos potencialmente nocivos a ele.

Primeiramente, o sistema neural necessário para senciênciadeve estar formado e ativo; os estímulos devem ser capazes deprovocar a transmissão de impulsos pelos nervos, desde os receptoressensoriais até o cérebro do animal, e suas estruturas cerebraisdevem estar operacionalmente preparadas para converteresses impulsos em sensações percebidas. Segundo, o animal precisaestar consciente para perceber sensações, já que a inconsciênciaanula a percepção. Terceiro, para o animal consciente sofrer e paraque o seu bem-estar seja comprometido, a natureza, intensidadee/ou duração das sensações devem resultar em experiências significantementenocivas ou aversivas.

Há evidência de efeitos a longo prazo das respostas fisiológicasa estímulos dolorosos aplicados em fetos. Essas evidênciasindicam a necessidade do fornecimento de alívio adequado da dor aofeto. A não ser que aparelhos implantados possam ser utilizados paramedir diretamente o bem-estar do feto, qualquer sinal de dor na mãedeve ser considerado como um sinal importante de dor e desconfortopotencial para o feto. O feto é mais suscetível à hipotermia durante acirurgia e há a necessidade de preveni-la.

VI - Controle da dor: anestesia, analgesia e sedativos.

Este item descreve os fármacos anestésicos, analgésicos esedativos e respectivas técnicas recomendadas para as principais espécies(rato, camundongo, cobaia, coelho e hamster) de fins científicos.

Éde fundamental importância uma equipe qualificada parareconhecer os sinais de dor. O veterinário é responsável pelos planosanestésicos e pela monitoração da profundidade anestésica na espéciealvo.

A dor resulta em alterações fisiológicas, bioquímicas e comportamentaissignificativas e indesejáveis ao animal e aos estudoscientíficos. Aliviar a dor de forma eficaz acelera o retorno à homeostasiaapós os procedimentos cirúrgicos. Em muitos casos, outrasestratégias, além da farmacológica, devem ser incluídas no controleda dor, além dos cuidados pós-anestésicos específicos.

O uso de agentes anestésicos, analgésicos e sedativos deveser adequado à espécie, apropriado para o propósito do estudo econsistente com a prática veterinária atual. Os procedimentos cirúrgicosdevem ser realizados mediante anestesia local ou geral apropriada.O controle eficaz da dor é obrigatório quando um animal serecupera da cirurgia. Deve-se atentar para a preparação pré-anestésicado animal, a monitoração da profundidade anestésica, os cuidadospós-anestésicos e o alívio da dor e estresse. Para selecionar umprotocolo de tratamento da dor, deve-se levar em conta que a dor e oestresse não são avaliados facilmente em animais. Desta forma, ospesquisadores devem pressupor que os animais sentem dor de formasimilar aos humanos.

6.1. Seleção do protocolo de anestesia

O agente anestésico, analgésico ou sedativo selecionado deveser seguro para o animal e para quem administra e interferir o mínimopossível no protocolo de pesquisa, conforme protocolo indicado esupervisionado por médico veterinário e previamente aprovado pelaCEUA. Devem ser considerados os seguintes fatores antes da seleçãodo protocolo analgésico e anestésico:

a) interações fisiológicas e influência nos resultados dos fármacosutilizados, lembrando que apenas em situações extremas, plenamentejustificadas, com embasamento científico, os opioides ouAINES não sejam utilizados;

b) espécie, linhagem, raça, idade e estado fisiológico doanimal (ex.: prenhez, estado de saúde);

c) grau de invasividade e duração da dor ou estresse, se foro caso;

d) plano ou profundidade necessários da anestesia;

e) se o estudo é terminal ou não;

f) duração da anestesia;

g) aspecto humanitário da técnica (ex.: facilidade de induçãoe recuperação da anestesia, efeitos adversos dos fármacos nos animais);

h)métodos de administração e dosagens;

i) experiência dos pesquisadores com a técnica (incluindo umveterinário com experiência apropriada);

j) disponibilidade de técnicas de monitoração anestésica (incluindonúmero adequado de pessoal treinado);

k) monitoração necessária durante o período de recuperação;

l)segurança dos pesquisadores; e

m) equipamentos disponíveis.

Os Grupos farmacológicos de sedativos (não analgésicos), sedativose analgésicos, anestésicos dissociativos estão relacionados naTabela 3 e os anestésicos injetáveis e de inalação gerais Tabelas 4 e 5.

Figura 1 - Exemplo de opções de controle da dor classificados,de acordo com o potencial do procedimento em resultar dorou estresse ("grau de invasividade")

6.2. Questões específicas a considerar

Há variações significativas na resposta a agentes anestésicos,analgésicos e sedativos, de acordo com a espécie, linhagem e sexo doanimal. Também pode haver variações individuais consideráveis entreanimais de mesma linhagem e sexo. Não se recomenda extrapolar osefeitos de um agente anestésico ou analgésico de uma espécie paraoutra, incluindo humanos. Deve-se consultar orientação especializadaao planejar um novo protocolo de anestesia e controle da dor.

Para minimizar as interações potenciais com o protocolo depesquisa, os efeitos farmacológicos dos agentes devem ser revisados. Éimportante considerar a resposta sistêmica ao procedimento anestésico,os efeitos do procedimento em si (ex.: canulação, cirurgia), da monitoraçãoanestésica (ex.: hipotermia, ventilação e perfusão tecidualinadequadas) ou de um controle inadequado da dor no pós-operatório,que podem produzir efeitos indesejados e afetar os dados da pesquisa.

6.3. Anestesia

Para a supressão da percepção da dor durante a realização deum procedimento, deve-se realizar anestesia geral ou local. Essa seçãodiscute sobre a seleção da técnica de anestesia mais apropriada eos passos para controle da anestesia.

6.3.1. Anestesia geral

A anestesia geral pode ser realizada com anestésicos injetáveise ou inalatórios. A indução anestésica é o período entre oestado consciente e o estado de anestesia cirúrgica (inconsciência oudissociação, quando se usar anestésicos dissociativos). A anestesiadeve preceder o início do procedimento, se manter durante a cirúrgicaaté o início do período de recuperação.

A anestesia geral envolve perda de consciência e sensaçãodolorosa e relaxamento muscular. O grau e a necessidade de depressãoda atividade reflexa, do tônus muscular e do sistema nervosocentral variam com o procedimento a ser realizado. A anestesia geralcom perda da consciência não garante analgesia eficaz, já que ainconsciência apenas evita a percepção de dor somente enquanto oanimal está sob anestesia. Entretanto, os estímulos nocivos são transmitidose processados pelo sistema nervoso central, durante os atoscirúrgicos, e podem desencadear hipersensibilidade central e produzirdor crônica e/ou neuropática. Portanto, embora a percepção de doresteja ausente enquanto o animal está inconsciente, tal percepçãopode estar aumentada no pós-operatório, quando não se tomam medidasantinociceptivas ou analgésicas no pré e trans-operatório. Outroponto a se considerar é o grau de depressão do sistema nervosocentral que os anestésicos ou as diferentes associações devem promoverpara que ocorra a insensibilidade durante o procedimento.

6.3.2. Anestesia inalatória

Pode ser induzida por meio de máscara facial e mantida pormeio de máscara facial ou tubo endotraqueal. Para prevenir ou minimizara exposição indesejada do operador aos gases anestésicos,deve-se prover, no recinto, um sistema eficiente de exaustão.

Para se administrar a anestesia inalatória, usa-se equipamentosanestésicos específicos, com fluxo diluente de oxigênio, com ousem ar comprimido, para fins medicinais, e, vaporizadores, para controleda concentração do agente inalatório utilizado. Em animais depeso até 7 kg, recomenda-se o uso de circuito avalvular, antigamentedenominado "aberto", como, por exemplo, o circuito de T de Ayre, oucoaxial de Bain ou Mapleson A ou D, entre outros, já que sãocircuitos de baixa resistência e pequeno espaço morto.

O uso de uma caixa ou vidro, onde o animal é colocadodentro de uma câmara, contendo uma gaze ou algodão embebido dolíquido anestésico, não deve ser usado, pois a concentração de anestésicoatingida dentro do recipiente é imprevisível e apresenta riscode óbito quando se usa anestésicos de fácil vaporização (ex.: isofluorano,sevofluorano). Além disso, o contato direto com o líquidoanestésico é desagradável para o animal, por causar irritação dasmembranas mucosas, além de não ser seguro para o operador.

6.4. Máscara facial

As máscaras faciais são utilizadas para induzir e manter aanestesia e fornecer oxigênio suplementar para animais anestesiadosou para aqueles que se recuperam da anestesia. A indução anestésicapor máscara pode ser utilizada como alternativa à indução em câmaraanestésica. Quando a primeira for usada, inicia-se sem o anestésico,para que o animal se acostume a respirar com o aparato apenas comoxigênio, em seguida, aumenta-se gradualmente, a partir de zero, aconcentração do anestésico inalatório, até a concentração apropriadacompatível com o plano anestésico almejado. Em seguida, pode-seintubar a traqueia ou continuar a usar a máscara facial. A concentraçãoé então reduzida para o que for adequado para manutençãoanestésica, mais detalhes na Tabela 5.

6.5. Câmara anestésica

Há câmaras anestésicas comercialmente disponíveis. O animalé colocado na câmara e o agente inalatório administrado com altofluxo de oxigênio (5 litros ou mais por minuto), até que o animalperca o reflexo postural. O animal é então retirado da câmara eentubado ou mantido com uma máscara facial para a manutenção daanestesia.

6.6. Vantagens da anestesia inalatória:

a) relativamente simples de administrar;

b) controle mais preciso da profundidade da anestesia;

c) indução e recuperação rápidas;

d) a provisão de oxigênio resulta em maior concentração deoxigênio no sangue durante a anestesia.

6.7. Desvantagens da anestesia inalatória:

a) necessidade de equipamento específico;

b) necessita boa ventilação e sistema de exaustão no recinto,para a segurança do operador.

6.8. Anestesia injetável

Para informações sobre os métodos de administração deagentes anestésicos injetáveis, consultar procedimento "Administraçãode substâncias".

6.9. Administração de anestésicos e via de predileção

6.9.1. Intravenosa (IV) - Na maioria das circunstâncias, deum terço à metade da dose calculada de anestésico é injetada rapidamente(normalmente por um período de 5 a 10 segundos) ecomplementada, se necessário, por anestesia adicional para produzir oefeito desejado. Após a indução IV, a anestesia pode ser mantida comanestesia inalatória ou IV contínua. Esta via apresenta como vantagema indução rápida da anestesia e permite que a dose administrada possaser adaptada para o animal, visando atingir e manter a profundidadedesejada de anestesia. Entretanto, não podemos deixar de ressaltar queesta via requer muita experiência por parte do operador, uma perfeitaimobilização do animal, para que não seja estressante ou recomendasea sedação prévia. Alguns agentes anestésicos são citotóxicos, seadministrados por via perivascular (ex. Propofol, Barbitúricos).

6.9.2. Intraperitoneal (IP) - Quando a via IP é utilizada, oinício da ação é mais lento do que com a administração IV e o animalpode passar por uma fase de progressiva ataxia ("cambaleante"). Podeexibir excitação e hiperatividade, para, em seguida, perder a habilidadede se endireitar, e finalmente perder a consciência. A anestesiafica progressivamente mais profunda até a perda do reflexointerdigital após estímulo doloroso. A vantagem da escolha desta viaé ser relativamente simples de administrar. Podemos citar algunspontos negativos para a escolha desta via, tais como a dificuldade deajustar a dose, de acordo com a resposta individual do animal, podeocorrer a sobredosagem ou subdosagem acidental. Quase sempre sãoadministradas doses relativamente grandes de anestésicos para produziro efeito necessário, sua absorção é lenta se comparada com aadministração IV. Efeitos residuais dos fármacos podem persistir porum longo tempo. Portanto, a recuperação total pode ser prolongada.Doses repetidas podem causar aderências abdominais e há risco considerávelde injeções nos órgãos e vísceras.

6.9.3. Subcutânea (SC) - Normalmente utilizada apenas paraadministrar sedativos. O início da ação é mais lento quando comparadocom outras vias de injeção. É relativamente simples de administrar.Entretanto, alguns fármacos (ex.: pentobarbital, tiopental)não podem ser administrados, pois causam dano ao tecido e escamaçãoda pele. As desvantagens citadas para injeções IP também sesomam a esta via.

6.9.4. Intramuscular (IM) - As injeções por esta via sãodolorosas e devem ser evitadas sempre que possível. Volumes maioresdevem ser administrados em múltiplos locais. O êmbolo deve serretraído antes da injeção para evitar injeção IV. Sua escolha, namaioria das vezes, é por ser relativamente simples de administrar.Entretanto, a injeção de um composto irritante pode causar dor ouestresse ao animal. Há relatos de reações teciduais e miosite com aadministração IM de alguns fármacos (ex.: quetamina). Em animaispequenos, o volume de injeção é grande se comparado ao volume demassa muscular, o que pode resultar em dor ou desconforto. Deve-seevitar em pequenos roedores. As desvantagens citadas para injeçõesIP também se aplicam a esta via.

6.10. Anestesia local

A anestesia local envolve a perda de sensação em uma áreadelimitada como resultado do bloqueio das terminações nervosas.Utiliza-se durante um procedimento cirúrgico ou para contribuir nocontrole da dor durante o período pós-operatório. Para procedimentossimples, como cateterização e procedimentos estereotáxicos, cremesou pomadas de anestésicos locais podem ser aplicados topicamente napele. Colírios com anestésicos locais podem ser utilizados em examesoftalmológicos.

A anestesia local para procedimentos cirúrgicos é mais usadaquando o animal já está acostumado ao manuseio e pode ser imobilizadoseguramente. Os anestésicos locais, como a lidocaína, podemser infiltrados na área alvo, ou injetados por via perineural, correspondenteà inervação local da área a ser anestesiada. Além das viastópica, infiltrativa e perineural, outras vias que podem ser utilizadasincluem a epidural, intratecal ou subaracnoide e intra-articular.

A anestesia local pode ser associada aos anestésicos injetáveisou inalatórios, para impedir a transmissão da dor (estímulonociceptivo) oriunda do sítio cirúrgico (ver "Analgesia multimodal oubalanceada").

6.11. Técnicas especializadas

6.11.1. Anestesia reversível - Muitos regimes de anestesiasinjetáveis envolvem períodos de recuperação prolongados, como, porexemplo, em roedores, nos quais os anestésicos administrados pelavia IP produzem em média 30 a 60 minutos de anestesia, seguidos detempo de recuperação de 2 a 4 horas. Durante o período de recuperação,os animais permanecem suscetíveis à hipotermia e apresentamalgum grau de depressão cardiorrespiratória. Esses efeitospodem ser superados ao se utilizar antagonistas. Os antagonistas,como a naloxona, estão disponíveis para opioides, bem como há aalternativa de utilizar agonistas-antagonistas (ex.: butorfanol e nalbufina),para reverter os efeitos adversos dos opioides agonistas totais(ex.: morfina, metadona). Os agonistas adrenérgicos-α2, como a medetomidinae xilazina, podem ser revertidos pelos antagonistas ioimbina,tolazolina e atipamezol e as benzodiazepinas, pelo flumazenil.

6.11.2. Anestesia neonatal - A anestesia de animais recémnascidosé um desafio, dada a capacidade reduzida de biotransformaçãoe eliminação dos fármacos. Desta forma, a resposta aos anestésicospode diferir consideravelmente dos adultos. A recuperaçãoprolongada pode reduzir os estoques de glicogênio hepático e resultarem hipoglicemia (baixa concentração de glicose no sangue). Outrosproblemas são a maior suscetibilidade à hipotermia, maior possibilidadede má função pulmonar e circulatória e a rejeição pela mãeapós o procedimento (especialmente em roedores). Por essas razões, épreferível utilizar anestesia por inalação (ex.: isoflurano) para que arecuperação seja rápida e a alimentação normal seja reiniciada tãologo quanto possível.

6.12. Cuidados gerais para a eficácia da anestesia

O controle eficaz da dor depende dos cuidados com o animalantes da indução da anestesia, do desempenho do procedimento, damonitoração da eficácia da anestesia durante o procedimento e doscuidados com o animal após o procedimento e recuperação.

6.12.1. Pré-anestesia - Deve-se aclimatar o animal ao manuseiopara reduzir os efeitos do estresse e a possibilidade de acidentescom o animal e o operador durante a indução. Avaliar se oanimal está saudável, registrar o peso corporal, para ajudar na monitoraçãoanestésica e no cálculo das doses. Em algumas situações, oregistro de consumo de alimento e água antes do procedimento auxiliarána monitoração pós-operatória.

6.12.2. Jejum - O período de jejum pré-anestésico é espécieespecífico.Em roedores pequenos e coelhos, é geralmente desnecessário,pois o vômito durante a indução não ocorre nessas espécies.Além disso, o jejum pode resultar em depleção de reservas de glicogênioe causar hipoglicemia. Alguns autores só recomendam o

jejum em coelhos em casos de cirurgia no sistema digestório. Coelhose roedores são coprofágicos (ingerem suas próprias fezes). Portanto,medidas para prevenir a ingestão de fezes são necessárias se o estômagoprecisar estar vazio para o protocolo de pesquisa. Deve-se terespecial atenção com as cobaias, pois cerca de 40% de seu peso vivoé ingesta.

Ao induzir um animal e monitorar a profundidade da anestesia,deve-se estar ciente dos estágios anestésicos. O tempo gastopara um animal passar por cada estágio depende do agente anestésicoutilizado e da resposta do animal. A anestesia pode ser induzida poragentes inalatórios ou injetáveis. Seja qual for a técnica escolhida, aanestesia deve ser administrada com equipamento apropriado, emuma sala específica, sem a presença de outros animais.

A anestesia pode ser mantida por agentes inalatórios administradosvia máscara facial ou tubo endotraqueal, infusão contínuade agentes injetáveis, ou uma associação de métodos. Mesmo durantebreves períodos de anestesia, é importante dar atenção ao suporte dasfunções corporais vitais do animal, particularmente os sistemas cardiovasculare respiratório.

Após a indução anestésica, posicionar o animal com suacabeça e região cervical em extensão para minimizar a obstrução dasvias aéreas. Nos casos de intubação traqueal, é necessário garantiruma via aérea adequada, especialmente para procedimentos longos.Para isso, é essencial a familiaridade com a anatomia específica daespécie e com a técnica.

A hipotermia (redução da temperatura corporal) pode se desenvolverrapidamente durante a anestesia e é uma das causas maiscomuns de óbito por anestesia, especialmente em animais menores,como roedores, que perdem calor rapidamente sob anestesia cirúrgica,dada a alta proporção da superfície corporal em relação ao peso.Deve-se manter a temperatura do corpo o mais próximo possível donormal, pela provisão de calor suplementar (ex.: bolsas quentes, colchõestérmicos). Por outro lado, deve-se tomar cuidado para nãosuperaquecer ou queimar o animal.

Para manter a hidratação, a infusão IV ou SC de fluidoterapia(ex.: Ringer com lactato) é especialmente importante em anestesiaslongas ou cirurgias invasivas. Os fluidos devem ser aquecidospara não contribuírem para a hipotermia.

Sob anestesia, os olhos dos animais frequentemente ficamabertos. Portanto, deve-se garantir que a córnea esteja protegida deressecamento e trauma, por meio de uso de pomadas oftálmicas.

A posição do animal deve ser monitorada, para evitar compressãoexacerbada de partes ou de todo o corpo. Também é importanteevitar o excesso de alongamento ou imobilização dos membros,pois há risco de danos nos nervos e vasos sanguíneos. Quandopossível, permitir que os membros fiquem em uma posição anatômicanatural. Quando os animais estão anestesiados ou imóveis por longosperíodos, é recomendado que o animal seja movido ou virado a cada20 minutos para promover o fluxo normal de sangue nos tecidos dasuperfície inferior.

6.12.3. Pré-medicação - A pré-medicação é geralmente administrada5-30 minutos antes dos agentes anestésicos. A grandevantagem do emprego destes fármacos é a potencialização da açãodos anestésicos, obtendo-se, desta forma, plano mais adequado deanestesia, além de significativa redução da dose dos agentes anestésicosgerais. Os agentes empregados na pré-medicação podem incluir:

a)analgésicos administrados antes de um procedimento, parainibir a nocicepção e a percepção de dor e, portanto, para prevençãode dor. Opióides, como a morfina, meperidina, tramadol, butorfanol emesmo o fentanil podem ser utilizados para este fim. No caso daneuroleptoanalgesia esses agentes podem ser associados a um sedativo(ex.: acetilpromazina + butorfanol).

b) sedativos (ex.: acetilpromazina, diazepam) em algumasespécies facilitam a imobilização. A acepromazina na dose de 3mg/kgcomo medicação pré-anestésica em camundongos, por exemplo, minimizaa ocorrência de excitação inicial que normalmente se observaquando se associa xilazina e quetamina nesta espécie, além de propiciarmelhor plano de anestesia.

c) anticolinérgicos (atropina ou glicopirrolato), para reduziros efeitos adversos de agentes anestésicos, como, por exemplo, reduziras secreções respiratórias e o estímulo parassimpático cardiovascular.Algumas espécies, como os coelhos, podem ser refratários àatropina, requerendo doses de até 2mg/kg para serem efetivas.

6.12.4. Profundidade da anestesia

O controle de monitoração e as técnicas empregadas sãodeterminadas pela espécie e tipo de procedimento. Os pesquisadoresdevem se familiarizar com os sinais específicos da espécie e dosestágios da anestesia. No mínimo, deve-se monitorar e registrar emfichas a profundidade da anestesia pela presença ou ausência dereflexos. Anestesia cirúrgica é obtida quando os seguintes reflexos etônus muscular normal estão ausentes:

a) reflexo postural: o animal não tenta se endireitar se colocadoem decúbito dorsal;

b) tônus muscular da mandíbula;

c) reflexo palpebral ao toque na pálpebra;

d) reflexo interdigital, quando o espaço interdigital é pinçado;

e)reflexo de pinçamento da cauda: ratos e camundongos;

f) reflexo ao pinçamento na orelha: cobaia, coelhos;

g) tônus do esfíncter anal.

6.13. Sistema respiratório a monitoração mais usual é realizadapor:

a) observações clínicas: monitora-se a amplitude, a frequênciae o padrão da respiração (aumento na amplitude e diminuição dafrequência se intensifica com o aprofundamento da anestesia);

b) monitor respiratório: alguns equipamentos podem não sersensíveis o suficiente para detectar apnéia em espécies pequenas,como o rato ou camundongo. Entretanto, há equipamentos disponíveiscomercialmente para tal;

c) oximetria do pulso: mede a saturação de oxigênio nosangue arterial;

d) capnometria e capnografia: mede a concentração expiratóriafinal de CO2 ;

e) hemogasometria: pH e pressão parcial de O2 e CO2 nosague venoso ou arterial, com cálculo automático da concentração debicarbonato, CO2 total e déficit ou excesso de bases;

A obstrução respiratória pode ser causada por secreções,objetos externos, língua ou posições anormais do pescoço. A respiraçãopode ser comprometida por compressão do tórax.

6.14. Sistema cardiovascular a monitoração mais usual érealizada por:

a) observações clínicas: cor das membranas mucosas, tempode preenchimento capilar, sons cardíacos e frequência cardíaca, qualidadede pulso periférico;

b) eletrocardiograma;

c) pressão sanguínea: pressão arterial sistêmica, pressão venosacentral;

d) débito cardíaco.

6.15. Temperatura do corpo

A temperatura do corpo pode ser monitorada por um termômetroretal, ou termômetro de infravermelho, em que se aponta ofeixe de infravermelho para a cavidade bucal ou o abdômen e seobtém o registro da temperatura corporal. A habilidade do animal deregular a temperatura é reduzida até que se recupere da anestesia. Emsua forma mais branda, a hipotermia aumenta o período de recuperaçãoanestésica e pode alterar o metabolismo. Quanto maior ahipotermia, maior a suscetibilidade do animal à sobredosagem anestésicae choque. Portanto, a temperatura ambiente da área de recuperaçãodeve ser de 30-35°C para roedores pequenos. Pode sefornecer calor suplementar (ex.: lâmpadas de aquecimento, bolsasquentes, incubadora, colchão térmico), mas se deve tomar cuidadopara não sobreaquecer o animal. A provisão de zonas aquecidas e nãoaquecidas na área de recuperação permitirá que o animal escolha suazona preferida após a recuperação. A temperatura do corpo do animaldurante o período de recuperação pós-anestesia e a temperatura doambiente devem ser monitoradas.

6.16. Período pós-anestésico - deve-se observar os animaisdurante a recuperação de anestesia para garantir que:

a) as vias respiratórias não sejam obstruídas;

b) a temperatura do corpo seja mantida;

c) eles não se machuquem;

d) a dor pós-operatória seja adequadamente controlada.

Quando se utiliza os anestésicos inalatórios, o animal devereceber oxigênio puro após o fim do procedimento, para que o agenteanestésico seja exalado pelos pulmões e a oxigenação garantida aostecidos.

Uma vez colocado, deve-se remover o tubo endotraqueal sóquando retornar o reflexo laringotraqueal.

Deve-se alojar individualmente os roedores pequenos e outrasespécies sociais durante a recuperação, para evitar ataques decompanheiros de gaiola e para prevenir a perturbação dos outrosanimais. No caso de cirurgia, o leito na gaiola deve ser adequado paraprevenir contaminação da ferida cirúrgica.

Se os animais tiverem passado por um procedimento invasivo,uma monitoração cuidadosa, durante o período pós-operatório,é essencial para avaliar se a analgesia foi eficaz e se analgesiaadicional é necessária. A dose ou frequência de administração deveser modificada de acordo com as necessidades do animal.

Os líquidos aquecidos (37°C) auxiliam na recuperação doanimal. Líquidos apropriados (ex.: Ringer com lactato, solução fisiológica)podem ser administrados IV lentamente, por via subcutâneaou intraperitoneal em uma dose de até 3-4% do peso corporal doanimal.

6.17. Analgesia

Os agentes analgésicos mais indicados para procedimentoscirúrgicos são os opioides e os anti-inflamatórios não esteroides (AINE).Os anestésicos locais podem ser utilizados para aliviar a dor nopós-operatório, por bloquearem as sensações de dor da área afetada.O protocolo de analgesia pode também incluir o uso de antagonistasreceptores N-metil-D-aspartato (NMDA) (ex.: quetamina em dosessubanestésicas), sedativos ou tranquilizantes.

A via oral pode ser utilizada para a administração de fármacosem dose única ou múltiplas (ex.: tratamento analgésico contínuofornecido via tabletes, ou em alimento, água ou gelatina). Entretanto,deve-se ter especial atenção quando da administração deagentes na água, pois vários agentes empregados para este fim possuemgosto amargo e; na maioria das vezes; o consumo adequado deágua não ocorre, especialmente se o animal já estiver com dor.

6.18. Analgesia preventiva ou protetiva

A dor pós-operatória é controlada mais prontamente quandose realiza a analgesia no pré-operatório. Isso é conhecido como analgesiapreventiva ou protetiva, administrada antes da incisão e continuamentedurante o tempo no qual os sinais nociceptivos são maiores(aproximadamente 6-36 horas no pós-operatório para a maiorparte das cirurgias). A analgesia protetiva previne o estabelecimentode sensibilização periférica e central causada por lesões incisionais einflamatórias e cobre o período de cirurgia e o pós-operatório imediato.

Aose administrar AINE no pré-operatório, deve-se dar preferênciapor inibidores preferenciais (carprofeno e meloxicam) e seletivosda ciclooxigenase 2 (coxibes), para minimizar a inibição deplaquetas e hipoperfusão renal.

6.19. Analgesia multimodal

A percepção de dor envolve uma multiplicidade de viasnociceptivas, mecanismos e sistemas transmissores (Figura 2). Portanto,é improvável que uma única classe de analgésicos alivie completamentea dor, independentemente da dose utilizada.

Normalmente; recomenda-se associar opioides e AINE. Oopioide diminui a transmissão nociceptiva periférica e central aferente.Em contraste, os AINE agem perifericamente para diminuir ainflamação local e a informação nociceptiva para o sistema nervosocentral como resultado de inflamação. Adicionar um anestésico localinjetável (ex.: lidocaina, bupivacaína) fornece analgesia adicional,pelo bloqueio da transmissão nervosa periférica da área em questão.

Utilizam-se os antagonistas do receptor NMDA (ex. quetamina)para reduzir a sensibilização central. Sedativos e tranquilizantesdiminuem a ansiedade e o estresse, que comprovadamenteelevam as respostas à dor.

Figura 2 - Locais de ação de agentes analgésicos nos mecanismosda dor

Fonte: Schofield e Williams (2002)

http://www.biosecurity.govt.nz/animal-welfare/analgesicpractice.htm

6.20.Monitoração da analgesia

Deve-se monitorar os animais cuidadosamente durante o pósoperatóriopara avaliar se a analgesia foi eficaz e se analgesia adicionalé necessária. Deve-se modificar a dose ou frequência de administração,de acordo com as necessidades do animal. Descreve-se,a seguir, as recomendações sobre a rotina de uso dos analgésicos,agentes a serem utilizados e a frequência de administração:

a) Procedimento relativamente pequeno (ex.: cateterizaçãovascular): uma dose única de analgésico sistêmico é administrada,seja um opioide ou um AINE. Alternativamente, pode ser apropriado,em algumas situações, injetar um anestésico local de longa duração(ex.: bupivacaína) na pele e tecidos circunjacentes.

b) Procedimentos cirúrgicos mais invasivos (ex.: laparotomia):a administração de analgésicos sistêmicos (AINE e opioide) érecomendada por 72 horas.

6.21. Ansiolíticos

A ansiedade pode elevar as respostas à dor e, desta forma,recomenda-se usar sedativos, que também facilitam a anestesia. Geralmentenão se utilizam sedativos para produzir sedação profunda ouhipnose. O efeito máximo deve ser observado antes da indução daanestesia.

6.22. Manuseio seguro de analgésicos

Por serem entorpecentes, a maioria dos agentes anestésicos eanalgésicos são fármacos controlados e devem ser armazenados emum armário trancado, em uma área segura. A legislação pertinenterege a aquisição, o uso e a manutenção de registros destas substâncias.

Algunsfármacos também se associam a questões significativasde saúde e segurança ocupacionais (ex.: riscos à saúde associadosà exposição crônica aos anestésicos inalatórios, como potencialcarcinogênico, mutagênico e teratogênico). Os pesquisadoresdevem estar cientes de qualquer risco potencial associado aos agentesque utilizam e tomar as precauções devidas.

Na escolha de anestesia dissociativa para um procedimentocirúrgico, salienta-se a importância de não se usar o anestésico dissociativo(ex. quetamina ou tiletamina) isoladamente ou apenas emassociação com um benzodiazepínico (ex. midazolam, diazepam, zolazepam),já que, apesar de ocorrer imobilização do animal, não háuma analgesia efetiva para o procedimento cirúrgico. Nestes casos,deve-se associar, ao anestésico dissociativo, um alfa-2 agonista (ex.xilazina, medetomidina) e um opioide.

Para garantir que o bem-estar animal seja mantido durante apesquisa científica, este guia orienta os usuários a lançarem mão detodos os recursos, objetivando minimizar a dor e o estresse aosanimais. Procedimentos e protocolos de controle da dor consistentes,planejamento detalhado de procedimentos cirúrgicos e de outros procedimentospotencialmente dolorosos, uma compreensão da biologiaanimal e conhecimento detalhado das ações fisiológicas e farmacológicasdos fármacos sedativos, analgésicos e anestésicos propostospara o uso nestas circunstâncias, devem estar disponível antes dequalquer manipulação que possa causar dor aos animais.

VII - Procedimentos cirúrgicos

Define-se procedimento cirúrgico como uma intervenção querequer acesso a um tecido vivo. No cenário científico, o tipo deprocedimento dependerá do propósito científico e pode variar desdeuma incisão superficial até a penetração de uma cavidade do corpo,intervenção em órgão(s) ou dissecação tecidual extensa, que deveráser realizada por Médico Veterinário responsável.

7.1. Os procedimentos cirúrgicos são realizados por diversasrazões:

a) coletar tecidos;

b) realizar biópsias (incisional ou excisional);

c) inserir cateteres vasculares de longa permanência (portalvascular) para permitir a coleta de sangue de animais;

d) inserir cateteres para monitorar a pressão sanguínea venosaou arterial;

e) infundir substâncias e/ou fármacos;

f) implantar cateteres ou aparelhos para coletar outros fluidoscorporais;

g) implantar eletrodos para registrar ou estimular locais específicosem estudos neurofisiológicos;

h) implantar equipamentos, como sondas de telemetria paramonitoração fisiológica e comportamental prolongada;

i) transplantar órgãos, seja no mesmo indivíduo (autólogo),seja em indivíduos da mesma espécie (homólogo) ou em espéciesdiferentes (xenólogo ou heterólogo), no mesmo local (ortotópico) ouem locais diferentes (heterotópico) no animal receptor;

j) desenvolver um modelo de estudo para um processo fisiológicoou patológico;

k) desenvolver e avaliar novas técnicas cirúrgicas para utilizaçãoposterior em animais e humanos.

Qualquer procedimento cirúrgico deve ser acompanhado deanestesia e analgesia apropriadas para o tipo de procedimento, bemcomo, da espécie envolvida. Dependendo dos objetivos do estudo, ao

final do procedimento cirúrgico, os animais podem recuperar a consciênciaou não. No segundo caso, o animal deve sofrer eutanásia nofinal do procedimento.

Quando um animal se recupera de uma intervenção cirúrgica,precauções especiais devem ser tomadas para minimizar o risco decomplicações, tais como dor ou infecção no pós-operatório. A naturezados procedimentos cirúrgicos coloca o bem-estar de um animalem risco significativo, mais frequentemente associado ao controleinadequado da dor tanto durante como após o procedimento.

7.2. Técnica asséptica

A cirurgia asséptica é definida como intervenção realizada deformas e por meios suficientemente livres de micro-organismos, paraque não se desenvolvam infecções. Procedimentos assépticos devemsempre ser utilizados, principalmente, quando se objetiva conseguirresultados após o procedimento cirúrgico.

A cirurgia asséptica é definida como uma intervenção emque se realiza um conjunto de medidas (esterilização do instrumental,desinfecção do ambiente, antissepsia do campo cirúrgico e equipe),com a finalidade de evitar a contaminação/infecção em locais semcontaminação.

Por alguns anos, havia uma visão de que procedimentosassépticos não eram necessários quando procedimentos de recuperaçãoeram realizados em roedores. Hoje se sabe que uma boa técnicacirúrgica é tão importante quanto a assepsia na prevenção de infecçõestrans e pós-cirúrgicas em roedores.

7.3. Os elementos de técnica asséptica envolvem:

a) realização de procedimentos cirúrgicos em uma determinadaárea em que foi feita a antissepsia;

b) preparação do sítio operatório para minimizar o risco deentrada de bactérias na ferida; isto normalmente envolve a remoçãode cabelo, pelo ou lã nas imediações da ferida cirúrgica pretendida ea limpeza e desinfecção daquela área;

c) cirurgião e assistentes cirúrgicos devem utilizar aventaiscirúrgicos e luvas estéreis (apenas luvas podem ser utilizadas emintervenções cirúrgicas em roedores e a campo) para efetuar a higienizaçãocirúrgica;

d) local da intervenção cirúrgica deve estar delimitado porcampos estéreis para criar um "campo" estéril adjacente; um métodode cobertura dupla é utilizado para procedimentos cirúrgicos grandesda cavidade abdominal ou torácica ou quando houver intervenção emvísceras;

e) utilizar instrumentos e kits estéreis;

f) somente instrumentos, campos cirúrgicos, kits e luvas estéreisdevem entrar em contato com o campo operatório;

g) superfícies estéreis devem ser mantidas secas para evitarque a umidade contamine a área cirúrgica.

A saúde clínica de todos os animais deve ser checada algunsdias antes da intervenção cirúrgica ser executada; atenção especialpara sinais de respiração ou função cardiovascular comprometidas oude infecção intercorrente. Além disso, quando os procedimentos estiverempropensos a comprometer sua habilidade em responder ainfecções (ex.: imunossupressão), os animais devem ser examinadosquanto a infecções subclínicas.

Os efeitos do transporte, introdução em novas instalações,novos grupos sociais e novo cuidador (técnico), sobre a resposta aoestresse (juntamente com alterações fisiológicas, bioquímicas e comportamentais)são bem documentados. O estresse cirúrgico exacerbaráessas alterações e não somente comprometerá a habilidade do animalde manter a homeostase durante o procedimento cirúrgico, mas aumentaráo risco de infecções no pós-operatório ao comprometer afunção imunológica. Um período de aclimatação deve ser dado, paragarantir que o animal tenha se recuperado desses estressores antes queseja marcada a intervenção cirúrgica. Este tempo pode variar com ascircunstâncias, mas é recomendado um mínimo de 10-14 dias paraanimais criados em laboratório.

7.4. Atenção especial deve ser dada durante ou imediatamenteapós uma intervenção cirúrgica, especialmente aos seguinteseventos:

a) perda de sangue devido a um trauma no tecido ou controleinadequado da hemorragia, resultando em perfusão e oxigenaçãocomprometidas do tecido e, se for grave, em colapso cardiovascular;

b)desidratação devido à perda descompensada de líquidodurante o procedimento cirúrgico, que será exacerbada pela exposiçãoe ressecamento dos tecidos, consumo restrito de fluido no pré-operatórioe consumo voluntário reduzido no período pós-operatório;

c) hipotermia devido ao comprometimento da termorregulaçãopelos agentes anestésicos, o que é um grande risco em pequenosroedores que possuam área de superfície extensa em relação à massacorporal e uma alta taxa metabólica;

d) hipóxia e má perfusão tecidual (i) como consequência dodecréscimo no volume de sangue, desidratação, desequilíbrio ácidobaseou hipotermia, ou (ii) associada com função respiratória inadequada;

e)distúrbios metabólicos devido à ativação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal(HPA) e mudanças associadas na função celular,com metabolismo alterado de glicose e proteína resultando emhiperglicemia e balanço nitrogenado negativo;

f) falência cardiovascular e/ou respiratória, riscos duranteprocedimentos cirúrgicos e no período pós-operatório imediato, nãosomente devido às complicações potenciais, listadas anteriormente,mas também porque muitos agentes anestésicos possuem efeitos depressivossignificativos e específicos em ambos os sistemas, um riscoexacerbado por mau gerenciamento da dose anestésica;

g) choque-hipovolêmico ou séptico.

Infecções no pós-operatório podem incluir infecção e rupturada ferida causada por uma falha nas técnicas assépticas; ou podem serresultado de um trauma excessivo no tecido, má homeostase, aparelhos,cateteres, os quais podem ser um receptáculo de infecção. Ahipotermia e agentes anestésicos modulam a resposta imune e aumentamo risco de infecção após procedimentos cirúrgicos.

7.5. A demora na cura do ferimento ou deiscência poderesultar de um ou mais dos seguintes fatores:

a) infecção;

b) comprometimento da viabilidade tecidual associada a umamá perfusão tecidual ou dano excessivo ao tecido causado por (i) maumanuseio do tecido, (ii) falha em manter um suprimento de sangueadequado, ou (iii) desidratação de tecidos durante a intervenção cirúrgica;

c)má posição de órgãos ou tecidos durante o fechamento;

d) escolha inadequada de materiais e/ou métodos de sutura, oque impede a perfusão tecidual e pode resultar em má posição dostecidos e um maior risco de o animal acidentalmente remover assuturas (observação: inflamação do local da ferida aumentará esterisco);

e) cura comprometida devido à função imunológica suprimida,seja como parte de uma intervenção deliberada (por exemplo,quando um animal é imunossuprimido após um transplante de órgãoou tem função imunológica suprimida devido à seleção genética oumanipulação genética), seja por associação com uma complicaçãoperioperatória como hipotermia.

7.6. Complicações com cateteres ou aparelhos implantadossão mais frequentemente devido a:

a) desenvolvimento de uma infecção no local do implanteonde o cateter ou aparelho é a fonte de uma infecção sistêmica ou (ii)uma infecção na pele que se desenvolve no ponto de saída de umcateter ou sonda, que pode resultar em infecção sistêmica, rastreandoo cateter ou aparelho ou um túnel subcutâneo, ou (iii) a introduçãosistêmica de um patógeno durante a lavagem de cateteres;

b) vazamento de conteúdo gastrintestinal ao redor de umafístula externa, causando supuração da pele ao redor;

c) cateteres, eletrodos ou aparelhos implantados sendo desalojadospelo animal ou seus companheiros de gaiola, resultando emhemorragia, trauma no tecido, contaminação da cavidade abdominalpor conteúdo gastrintestinal ou secreções, sepse e, possivelmente,morte, devido a um choque hemorrágico ou séptico;

d) vazamento de conteúdo gastrintestinal, secreções pancreáticasou bile na cavidade abdominal causando peritonite;

e) falha de cateteres vasculares devido à trombose ou infecção;

f)danos em órgãos como o rim devido a infarto por trombosliberados a partir do implante;

g) bloqueio ou infecção de cateteres biliar ou pancreático, osquais, devido à natureza das secreções, resultam em colecistite einsuficiência hepática ou pancreatite aguda;

h) tamanho, peso ou local de implante dos cateteres e aparelhosque impactam nas atividades normais de um animal e, quandoimplantados nas cavidades do corpo, impactam na função dos órgãosvitais.

Isolamento social pode ser necessário durante a recuperaçãoda anestesia para prevenir agressão de outros membros de um gruposocial. Entretanto, em alguns casos, o isolamento contínuo pode sernecessário, para prevenir danos ao local da incisão/cateter/instrumentoscirúrgicos ou implantes. Nestes casos, recomenda-se alojar o animalem gaiola que lhe permita o contato visual, auditivo e olfatóriodeve ser mantido.

Após um procedimento cirúrgico, o padrão de comportamentoque indica que um animal está sentindo dor é variável dependendoda espécie e do grau de invasividade do procedimentocirúrgico.

7.7. O risco potencial ao bem-estar do animal originado porprocedimento cirúrgico pode ser reduzido, quando certos cuidados sãotomados no pré, trans e pós-cirúrgico, tais como:

a) desenvolvimento e revisão de planos de controle da dor,incluindo analgesia preventiva ou protetiva;

b) seleção de agentes anestésicos e analgésicos apropriadospara a espécie e o procedimento;

c) monitoração da profundidade da anestesia e o controle dosefeitos adversos da anestesia;

d) uso de procedimentos assépticos em todos os procedimentosde recuperação;

e) competência dos envolvidos em todos os aspectos doprocesso, especialmente na administração e monitoração do anestésicoe analgésico e desempenho dos procedimentos cirúrgicos.

7.8. Equipe técnica

Cirurgias frequentemente envolvem a utilização de técnicasnovas ou a adaptação de métodos cirúrgicos que são utilizados emoutras espécies. Nestas circunstâncias, quando o cirurgião não estiverfamiliarizado com o procedimento em uma espécie específica, comsua abordagem anatômica, com a viabilidade do procedimento novoou recentemente proposto, para minimizar complicações cirúrgicas epara desenvolver e revisar estratégias de administração do pós-operatório,os seguintes passos são propostos:

a) desenvolver procedimentos desfechos todas às vezes que ador ou o desconforto for detectado nos animais em estudo, com afinalidade de evitar sofrimento desnecessário;

b) realizar um estudo da anatomia topográfica, utilizandoamostras de cadáver para se familiarizar com os planos e acidentesanatômicos, para avaliar a viabilidade do procedimento proposto eabordagem cirúrgica ideal e para identificar riscos cirúrgicos;

c) realizar a intervenção cirúrgica como um procedimentoprévio de não recuperação em um número suficiente de animais parater confiança para lidar com o animal ao longo do período de recuperação;este passo também permitirá uma avaliação da técnicaanestésica e terapias de apoio que melhor manterão a estabilidadefisiológica durante os procedimentos cirúrgicos;

d) desenvolver um plano de gerenciamento do pós-operatóriobaseado nas consequências e riscos previstos;

e) conduzir um estudo piloto que permita a recuperação deum número limitado de animais;

f) analisar e rever os procedimentos cirúrgicos e anestésicose planos de gerenciamento pós-operatório e da dor;

Realizar um curso e trabalhar com um mentor experiente érecomendado para pessoas que precisam adquirir habilidades em técnicascirúrgicas básicas. Modelos de simulação podem ser utilizadospara praticar técnicas de sutura e colocação de cateteres.

Ações que reduzem ou minimizam a magnitude e duração deperturbações metabólicas associadas ao estresse cirúrgico e complicaçõesno pós-operatório auxiliam nos objetivos de qualidade de vidaanimal e na promoção dos princípios de Refinamento e Redução. Umresumo de estratégias para minimizar os riscos ao animal está listadona Tabela 8.

A complexidade e extensão das questões envolvidas em procedimentoscirúrgicos requerem avaliação cuidadosa para identificarriscos, desenvolver estratégias para minimizar ou gerenciar esses riscose desenvolver um plano eficaz de controle da dor. Um estudopiloto pode ser necessário para informar este processo. O planejamentotambém deve incluir uma avaliação da disponibilidade eadequação de instalações e equipamentos, bem como das habilidades,conhecimento e experiência das pessoas envolvidas. Uma vez que umplano de gerenciamento foi formulado, uma análise contínua irá identificaroportunidades para refinar métodos e procedimentos.

viii - Toxicologia

Toxicologia, segundo um consenso estabelecido entre as sociedadesmundiais que atuam nessa área, é o estudo dos efeitosadversos de agentes químicos, físicos ou biológicos sobre organismosvivos e no ecossistema, incluindo a prevenção e ou minimizaçãodesses efeitos.

8.1. Testes toxicológicos

Testes toxicológicos podem identificar potenciais efeitos adversosà saúde ou demonstrar a segurança de novas substâncias químicase novos produtos, fornecendo assim a base para a salvaguardada saúde humana e animal. Estes testes são importantes para a análisede risco. Testes ecotoxicológicos podem ser exigidos pela legislaçãopara caracterizar perigos e para avaliação de risco ambiental tantopela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), quanto porministérios responsáveis pelo registro de novas moléculas para variadosfins.

Autoridades reguladoras nacionais e internacionais necessitamequilibrar as preocupações entre o bem-estar animal e a necessidadede obter informações toxicológicas. A toxicologia é umcampo cada vez mais harmonizado internacionalmente e considerauma vasta gama de organizações preocupadas com o desenvolvimentoe validação de testes alternativos.

Para que os estudos de segurança e risco de novos produtospara utilização no animal, e aí inclui-se o próprio homem, e emrelação ao impacto no meio ambiente sejam considerados por agenciasregulatórias, é necessária uma observância total às recomendaçõesdos guias (guidelines) internacionalmente aceitos. Com relaçãoaos estudos científicos, recomenda-se que esses mesmos guiassejam seguidos, sempre que possível, pois neles são considerados osaspectos éticos e a aplicação dos 3Rs (Substituição, Redução e Refinamentodas técnicas).

8.2. Metodologias adotadas para avaliação de risco.

Estão disponíveis para estudos toxicológicos, vários protocolosinternacionalmente aceitos, e alguns exemplos estão listados aseguir:

a) toxicidade aguda: estudo da toxicidade produzida por umasubstância teste, quando administrada uma ou mais vezes em umperíodo que não exceda 24 horas;

b) toxicidade subaguda: estudo da toxicidade produzida poruma substância teste, quando administrada diariamente durante períodonão superior a um mês. Os protocolos internacionais usualmenteabrangem período que pode variar entre 14 ou 28 dias;

c) toxicidade subcrônica: estudo da toxicidade em que asubstância teste é administrada diariamente por pelo menos 90 dias;

d) toxicidade crônica: estudo da toxicidade em que a substânciateste é administrada diariamente por pelo menos 6 meses, comexigências variáveis para diferentes espécies e para as diferentes necessidadesinvestigativas;

e) irritação: avaliação de risco irritativo para substâncias, nosolhos, pele e mucosas. Para esse tipo de avaliação, já existem métodosalternativos validados pelo CONCEA e devem ser usados obrigatoriamente;

f)carcinogenicidade: avaliação do potencial de uma substânciapara causar câncer. Esses estudos são de longa duração, prolongando-sepor quase toda a vida do animal (roedores) e diante dessasituação, recomenda-se que sejam desenvolvidos somente em instalaçõesou laboratórios de utilização com condições sanitárias e estruturaiscapazes de manter a vida desses animais por longos períodossem interferências, a não ser aquelas previstas na proposta do estudoaprovada por Comissão de Ética;

g) teratologia: estudos que visam a determinação do potencialde uma substância para causar desenvolvimento pré-natalanormal, a produção de anomalias congênitas.

h) reprodução: Estudos que visam à determinação do potencialde uma substância para causar desenvolvimento anormal noperíodo perinatal, incluindo-se os estudos de uma ou duas geraçõessequenciais. Sempre que possível, deve-se optar pelos protocolos deuma geração com extensão de observações, no intuito de diminuir onúmero de animais incluídos nos estudos;

i) genotoxicidade: estudos que avaliam a habilidade de umasubstância para induzir alterações no material genético (DNA, nucleotídeos,cromossomos);

j) estudos ecotoxicológicos: avaliam o risco e a segurança desubstâncias para o ecossistema.

8.3. Questões essenciais referentes ao bem-estar animal aserem consideradas.

As considerações essenciais ao bem-estar animal para conduçãode estudos de avaliação de risco e segurança são:

a) avaliar a possibilidade de utilização de métodos alternativosà utilização de animais.

b) minimizar a utilização de animais, lançando mão delineamentoestatisticamente projetado, protocolos internacionalmenteaceitos e validados, ainda que se trate de estudos acadêmicos - considerarprotocolos descritos em guias que contemplem as exigênciasregulatórias em parte ou em sua totalidade.

c) minimizar a dor e a perturbação quando essas condiçõesforem essenciais ao estudo.

8.4. Métodos alternativos

Há um amplo escopo para a aplicação do Princípio dos 3R'sna utilização de animais em estudos toxicológicos. Cada vez mais,alternativas validadas a animais sencientes são utilizadas em testes detoxicidade e, nesse sentido, a validação de um método é definidacomo um processo pelo qual a confiabilidade e relevância de umprocedimento são estabelecidas para um fim específico. Todavia, nassituações em que a finalidade é regulatória, deverão ser usados osdelineamentos propostos pelo CONCEA e quando não houver umalegislação nacional ordenatória a orientação é basear-se nas diretrizesinternacionalmente aceitas para esse fim.

8.5. Projetos de estudo para atender às necessidades regulatórias

Nosentido de evitar a utilização desnecessária de animais, éessencial observar as exigências regulatórias especificadas pelas autoridadesnacionais e internacionais e que estão descritas nos guias.Essas incluem os tipos de teste, espécies-alvo, via de administração eparâmetros estatísticos, de forma a se obter o máximo de informaçõescom o mínimo de envolvimento animal e resultados aplicáveis eseguros.

O racional para estudos que visam à determinação de risco esegurança de novas moléculas inclui o seguinte: estudos de genotoxicidade,estudo da toxicidade aguda em substituição ao cálculo daDL50,que foi abandonado pela Organização para a Cooperação eDesenvolvimento Econômico (OCDE) em 2001; estudos de toxicidadeem doses repetidas (duas espécies, uma roedora e uma nãoroedora); estudos de toxicidade para a produção e para novos fármacos;adicionalmente estudos de segurança farmacológica específicos.Os protocolos para conhecimento do potencial irritativo oucorrosivo para olhos, pele e mucosas devem ter sua aplicabilidadeavaliada caso a caso, uma vez que o dano é presumido, tornam-sedesnecessários para substâncias ou formulações nas quais propriedadesquímicas ou físicas sugerem que essa forma de toxicidade éprovável, por exemplo, pH acima de 11,5 ou abaixo de 2.

Ainda no sentido de minimizar e racionalizar a utilização deanimais para estudos de toxicologia, o planejamento deve incluir abusca de informações relacionadas à molécula (pKa, pH, estruturaquímica, caracterização físico-química etc), parâmetros que podemser base para cálculos que facilitem estabelecer concentrações parateste e a indicação de vias de administração ou de exposição, eliminandoa possibilidade de procedimentos desnecessários.

8.6. Minimizar a dor e a perturbação

Quando alternativas não estão disponíveis, não estão previstasnos guias, ou não são permitidas pelos órgãos de registro, háum forte indicativo para que os estudos de toxicidade conduzidos emanimais sejam acompanhados de observação de sinais clínicos queindiquem dor e perturbação. No entanto, deve-se ter em mente que atoxicologia não visa exclusivamente a determinação do risco, masprimordialmente a determinação clara da segurança. Dentro dos limitesda legislação, a minimização de dor e perturbação deve ser umrequisito primordial. Regulamentações de testes de toxicidade normalmentepermitem somente o tratamento de dor e perturbação emanimais se as providências para minimizar essas situações não apresentareminterferência direta com o estudo.

Assim, os animais nesses estudos são raramente tratados comanalgésicos ou outras providências, tendo em vista a probabilidade demascarar resultados. Nesse sentido, é essencial que os protocolospropostos tenham desfechos claramente definidos, descrevendo quandoos animais devem ser removidos do estudo por razões humanitárias,e devem incluir previamente os critérios descritos para determinarquando os animais podem ser removidos, tratados ou recebereutanásia. A morte como desfecho deve ser evitada em todas ascircunstâncias a não ser que seja uma exigência legislativa obrigatória.A identificação e desenvolvimento de biomarcadores detectáveispodem servir como desfecho antecipado. Esses devem ser conectadosao mecanismo ou modo de ação de toxinas e podem serclínicos, patológicos, fisiológicos ou comportamentais. Esses biomarcadorespodem ser observáveis, como comportamento, ou mensuráveis,como a temperatura do corpo e pressão sanguínea, ou dadosresultantes de análises bioquímicas. Avanços em telemetria não invasivapermitem que ECG e dados de pressão arterial sejam registradoscom mínimo de impacto no animal.

Alguns autores consideram que a marcha da pesquisa toxicológicadeve considerar os desfechos humanitários baseados emprocedimentos que causem quantidade mínima de dor e perturbaçãoaos animais e que detectem e monitorem sinais precoces de dor edesconforto. Biomarcadores urinários poderiam fornecer indicadoresprecoces e sensíveis de desconforto devendo-se considerar que acoleta de urina pode ser não invasiva. O monitoramento do estado doanimal no transcorrer do estudo deve ser feito de forma responsávele incluir, além do exame clínico diário, a observação constante, bemcomo o amparo de análises clínicas por profissional capacitado que,em conjunto, poderão determinar o ponto final da participação decada um dos animais na investigação. É aconselhável, para essescasos, o acompanhamento de um médico veterinário. Adicionalmente,a implementação de um estudo piloto pode ajudar a prever quaiscritérios serão utilizados para determinar o momento da exclusão doanimal por eutanásia, evitando-se sofrimento desnecessário.

iX - Procedimentos para modificação no comportamento animal

Emalguns projetos de pesquisa, o comportamento animal émodificado ou manipulado para obter um resultado científico. Issopode envolver tratamentos como o uso de recompensas ou estressoresbiológicos, incluindo imobilização física, privação social, administraçãode drogas, restrição de comida ou água ou exposição a estímulosque causam dor ou distresse.

O comportamento de animais é modificado ou manipuladoem muitos campos de pesquisa científica, incluindo psicologia, ciênciado comportamento animal (etologia), pesquisa fármaco-comportamentale pesquisa da dor, pesquisa genética e neurociência.

9.1. Estratégias para modificar o comportamento:a) esquiva: o animal recebe opções e pode tomar uma decisãoquanto a seu comportamento baseado em preferência;b) manipulação de variáveis sociais: incluindo densidade populacional,experiência social prévia, introdução de novos animais"intrusos" em um grupo estabelecido, separação social, isolamento ouperda;c) recompensa: uma recompensa (reforço positivo) pode seroferecida quando o animal completa com sucesso uma tarefa que foitreinado a fazer. Em alguns casos, a recompensa é um "agrado", comoum alimento ou bebida altamente saborosos. Em outros casos, oacesso do animal à comida e água é limitado antes de uma sessão detreino e o animal recebe alimento e água adicionais como recompensa;d)punição: os estímulos que são considerados aversivos podemvariar entre espécies e podem incluir gaiolas novas ou nãofamiliares, sabores desagradáveis, presença de um predador, um animalou grupo social estranho, extremos de luz, temperatura ou som,um sopro de ar frontal, ou outros estímulos aversivos. Os animaisresponderão, escapando ou evitando os estímulos.No item "c", pode ser utilizado alimento sólido ou líquidocomo recompensa, mesmo em animais bem alimentados (saciados). Arestrição de comida ou água é normalmente alcançada, limitando-se aquantidade diária disponível para o animal ou limitando o períododiário de acesso. Se a restrição for prolongada, poderá ocorrer desidrataçãoou perda de peso corporal. O impacto da restrição dealimento ou água é descrito no item Modificação no consumo dealimento e água. Privação considerável de água ou alimento deve serevitada.9.2. As respostas básicas comportamentais e fisiológicas(medo e estresse) são minimizadas se o animal for capaz de controlaros estímulos aversivos. Situações nas quais os animais não podeminfluenciar ou controlar a experiência aversiva são especialmente perturbadoraspara eles. Respostas comportamentais de medo e estresseincluem:a) escape: interromper contato com um estímulo aversivo;b) recusa: um comportamento assimilado que previne umaexperiência aversiva;c) diminuição da higiene, consumo de alimento, nível deatividade, exploração, atividade sexual, comportamento materno eperda de peso corporal;e) aumento do comportamento de "congelamento".Esses comportamentos de resposta são típicos da espécie,mas os estímulos aversivos que os evocam são assimilados. Estímulossensoriais aversivos ou negativos não podem ser utilizados e estímulosde dor ou enjoo devem ser evitados. Caso seu uso sejanecessário, o nível e duração dos estímulos devem ser minimizados eo escape do estímulo deve estar disponível.9.3. Agrupamentos sociais apresentam efeitos comportamentaise fisiológicos potencialmente benéficos e também adversos namaior parte das espécies de animais de laboratório:a) os efeitos positivos do agrupamento social incluem higienee cuidados maternos e paternos, afeição social (desenvolvimentode vínculos) e influencia no desenvolvimento de filhotes. Estimularo cérebro com informações sensoriais afeta o crescimento e ainterconectividade do cérebro, afetando assim a função. O enriquecimentodos estímulos do ambiente possui efeitos permanentes noscérebros de ratos e esse efeito pode ocorrer até em animais idosos. Aprivação social pode resultar em prejuízo ao crescimento;b) os efeitos negativos incluem agressividade, brigas e alteraçõesimunológicas e cardiovasculares, além de depressão induzidapor estresse social. Em muitos casos, os efeitos negativos em animaissubordinados, nos casos de hierarquias de dominância social, somemcom o tempo. Entretanto, se comida ou água for restringida, osanimais subordinados podem continuar a ser afetados adversamente.

9.4. Em algumas situações, o protocolo de pesquisa requeralojamento individual, como, por exemplo:

c) consumo individual de alimento e água do animal deve serregistrado;

d) efeitos farmacológicos sobre o comportamento de umindivíduo podem reduzir sua habilidade de se alimentar, ou induzi-loa ser atacado por companheiros de gaiola;

e) instrumentos de modificação de comportamento e de registrosão anexados à gaiola e respostas individuais dos animais sãonecessárias;

Privação social ou interações sociais negativas não podemser utilizadas. Quando espécies sociais necessitam permanecer fisicamenteisoladas, o contato visual, auditivo e olfatório deve sermantido.

Déficit neurológico: criação de anormalidades na estruturaou função do sistema nervoso. Por exemplo, por alterações genéticas,por uso de substâncias químicas tóxicas ao sistema nervoso, ou pordanos físicos em áreas específicas do cérebro, medula espinhal ounervos. Essas anormalidades assemelham-se às doenças neurológicasque ocorrem em humanos naturalmente e que envolvem disfunçãocomportamental ou sensorial. Exemplos incluem modelos quimicamenteinduzidos da Doença de Parkinson; dano físico em vasos sanguíneospara causar acidente vascular cerebral; e linhagens de camundongoscom uma alta predisposição genética à epilepsia ou convulsões.

Dependendodo local e gravidade da patologia, após o déficitneurológico ser induzido, atenção especial deve ser dada aos animais.O déficit pode diminuir a habilidade de cuidar de si mesmo. Suaposição na hierarquia social provavelmente será baixa, uma vez que odéficit for criado, e isso poderá resultar em conflitos e habilidadereduzida de obter alimento quando alojados com o grupo. Em algumassituações, eles necessitam ser alojados em isolamento físico.Primatas não humanos alojados em pares podem ser cuidados, emparte, por seu companheiro de gaiola.

f) drogas: alterações na função do sistema nervoso através douso de substâncias químicas. Por exemplo, drogas analgésicas alterama percepção de dor do animal e retardarão ou eliminarão a respostacomportamental ao estímulo de dor;

g) aparato: equipamentos que contêm o animal apresentamestímulos ou registram respostas comportamentais;

g.1) aparato inclui:

1. instrumentos de imobilização (gaiola metabólica, imobilizadorde cabeça);

2. câmaras de registro (incluindo monitor de atividades, plataformade telemetria);

3. aparato especial (ex.: área de campo aberto, labirinto, rodagiratória, tambor rotativo, câmara operante/"caixa de Skinner");

4. aparato de memória e aprendizado espacial utilizado comroedores (ex.: labirintos como braço radial, plataforma circular deBarnes, labirinto aquático de Morris);

h) Estudos de neurociência de comportamento acordado: incluemestudos das funções mais "elevadas" do cérebro, como a percepção,a memória e o controle motor, que envolvem a participaçãoativa do animal. Esses estudos requerem um estágio preliminar extensivo,durante o qual o animal é treinado para realizar uma tarefa etem implantado, cirurgicamente, os instrumentos de coleta de dadosou de monitoramento. Os dados são coletados diariamente por umperíodo que pode se estender por anos.

9.5. Cuidados a serem considerados para a modificação docomportamento:

Sinais gerais de dor ou desconforto devem ser monitoradosconstantemente. Atenção especial é requerida aos protocolos de restriçãode fluídos que podem resultar em perda rápida de mais de 15%do peso do corpo, sede, secura das membranas mucosas, quantidadereduzida de urina, consumo reduzido de alimento, perda de elasticidadeda pele, olhos fundos, tremor, letargia e choque ou colapsocardiovascular.

Em todos os casos nos quais a pesquisa pode ter impactosobre o consumo de alimento ou água de um animal, uma justificativacientífica circunstanciada deve ser fornecida à Comissão de Ética noUso de Animal (CEUA) ao buscar aprovação.

Animais com aparência descuidada ou suja, produção reduzidaou ausente de urina ou fezes, postura anormal, fraqueza ouperda de função generalizada ou localizada, ou movimentos geraisreduzidos devem ser monitorados cuidadosamente.

Aumento de mordidas, de escape e de comportamento decongelamento; produção de lágrimas, incluindo lágrimas vermelhasou porfiria; ranger de dentes; vocalização aumentada; movimentoexacerbado ou reduzido; auto isolamento, agressividade exacerbadaou reduzida; respiração rápida, de boca aberta ou exagerada; alteraçãode hierarquias sociais, também devem ser monitorados;

Todos os passos devem ser tomados para garantir que a dore o desconforto sejam minimizados. Portanto, a pesquisa envolvendomodificações de comportamento deve ser justificada cientificamente,aprovada pela respectiva comissão de ética para o uso de animais econduzida de forma a minimizar qualquer efeito adverso para osanimais. A Tabela 6 resume procedimentos gerais e consideraçõespara minimizar os efeitos adversos da modificação de comportamento.

X.INDUÇÃO DE TUMOR

Tumores podem ser induzidos em animais de laboratório pormeio de transplante de células tumorais específicas (frequentementede origem humana), exposição a substâncias cancerígenas ou infecçãocom vírus indutores de tumor. Com o advento das técnicas de manipulaçãogenética, linhagens de animais podem ser estabelecidaspara desenvolver tumores espontâneos específicos.

Por meio da indução de tumores pode-se investigar sua biologiae avaliar a eficácia de vários tratamentos para inibir ou revertero crescimento de tumor e o desenvolvimento metastático. O nível efrequência de tratamentos dependerão dos agentes de interesse. Osanimais podem ser submetidos a uma única ou múltiplas exposiçõese mantidos em isolamento sob barreiras sanitárias.

O procedimento utilizado com maior frequência envolve oenxerto de células tumorais no animal hospedeiro, por transplante decélulas ortotopicamente, isto é, no tecido ou órgão de origem, ouectopicamente, geralmente no espaço subcutâneo no flanco. O transplanteenvolverá um procedimento cirúrgico, exceto nos casos em queas células tumorais forem transmitidas via intravenosa ou implantadassubcutaneamente.

A fim de aumentar a absorção do enxerto, o estado imunológicodo hospedeiro pode ser modulado por irradiação no corpointeiro ou pelo uso de agentes imunossupressores. Podem ser utilizadosanimais imunologicamente comprometidos, tais como camundongosnude (atímicos), camundongos SCID (imunodeficiência gravecombinada) e camundongos RAG (sem células B e T). Uma combinaçãodessas estratégias pode ser empregada.

O estudo de tumores estabelecidos pode envolver a administraçãode biomarcadores ou moduladores metabólicos para estudara regulação de desenvolvimento e migração de células, colheita decélulas tumorais em vários estágios de desenvolvimento para umaanálise in vitro mais aprofundada ou a variação de vários regimesterapêuticos.

Existe uma tendência à utilização de modelos ortotópicosque facilita o estudo de interações entre as células tumorais e tecidoshospedeiros. Estes tipos de estudo são relevantes principalmente paracompreender o crescimento do tumor, o desenvolvimento de metástasee a eficácia de estratégias terapêuticas que são específicas aotecido hospedeiro. Da mesma forma, animais transgênicos e nocautessão modelos de eventos celulares e moleculares mais precisos e sãocada vez mais utilizados em estudos de câncer.

10.1. Considerações de bem-estar animal

O grande impacto no bem-estar dos animais em estudosindutores de tumor está associado ao desenvolvimento e biologia dotumor, aos efeitos colaterais de agentes terapêuticos, às consequências

da cirurgia e aos efeitos colaterais de tratamentos imunomoduladores,como a irradiação. Efeitos adversos, em especial o tamanho do tumor,dor e subnutrição, irão variar com o tipo de tumor. Dependendo dolocal de implante, o crescimento do tumor pode afetar a mobilidadede um animal ou, especialmente em transplantes ortotópicos, resultarem sérias complicações fisiológicas. Somamos a isso, o desenvolvimentoe disseminação de metástases em órgãos como o fígado oupulmões.

Estudos neuroquímicos recentes indicam que os tumores sãoassociados ao estado de dor persistente diferente da dor inflamatóriaou neuropática. Entretanto, foi sugerido que os níveis de dor sãosignificativamente menores com enxertos ectópicos do que com enxertosortotópicos. Neste último caso, os animais estão propensos asentir a dor de forma similar aos humanos.

A caquexia, um estado de subnutrição grave, é concomitanteao desenvolvimento do tumor. Embora haja certa diminuição no consumode alimento, alterações metabólicas significativas são a razãoprimária para a perda de peso, perda de massa muscular, anemia eanorexia, a gravidade desses efeitos varia com diferentes modelosanimais. Outros fatores da perda de peso incluem os efeitos da radioterapia,nos casos em que o trato gastrointestinal for danificadodurante o tratamento o efeito atenuador do tumor na resposta metabólicaà cirurgia com alterações na permeabilidade do intestino; econsumo reduzido de alimento associado aos efeitos colaterais deagentes quimioterápicos.

Complicações potenciais do procedimento cirúrgico podemafetar o desenvolvimento do tumor e ter implicações tanto para ainterpretação de dados como para o impacto do procedimento nobem-estar do animal. A hipotermia, uma complicação cirúrgica comum,suprime a função imunológica e resistência do hospedeiro ametástases tumorais. A escolha de agente anestésico pode afetar oenxerto do tumor e a administração da dor no pós-operatório podeafetar o desenvolvimento do tumor.

Os efeitos colaterais específicos dos agentes quimioterápicostambém necessitam ser levados em consideração. Eles podem incluiros efeitos imediatos de náusea ou perda de apetite e efeitos a maislongo prazo, incluindo a perda de peso e alterações patológicas comocomprometimento das funções hepáticas e renais.

10.2. Monitoramento da dor e distresse

As diretrizes do Comitê de Coordenação da Pesquisa doCâncer do Reino Unido fornecem uma discussão ampla de como obem-estar do animal deve ser monitorado em animais que foramsubmetidos à indução de tumores e, em especial, a implementação dedesfechos humanizados nas estratégias de monitoramento.

O monitoramento da dor em roedores e coelhos deve incluira verificação da expressão facial dos animais, com o enquadramentona escala de expressão facial conforme literatura disponível. As publicaçõescientíficas sobre diagnóstico da dor devem ser acompanhadase incorporadas assim que novos métodos se tornem disponíveis.

A interpretação das alterações no peso corporal de um animaldeve ser feita cuidadosamente, pois este dado sozinho pode não serum indicador confiável. Com o crescimento do tumor, o peso dotecido do tumor aumenta e, às vezes, o líquido fica acumulado nostecidos corporais (edema) e cavidades do corpo (ex.: ascite). Isso podemascarar perdas significativas de peso corporal e a interpretação detais alterações deve ser feita de forma crítica, levando em consideraçãooutros fatores, como a condição do corpo e comportamento.

É evidente o valor de novas técnicas de imagem, como a bioluminescência,ultrassom com agente de contraste aumentado, tomografiacomputadorizada volumétrica e microscopia de vídeo para monitoraro crescimento do tumor e disseminação da metástase. Entretanto,as imagens devem ser associadas com dados específicos da função doórgão para avaliação das alterações e estabelecimento de desfechos.

10.3. Minimização da dor e distresse

O protocolo escolhido deve ser compatível com os objetivosdo estudo e ter mínimo risco para o animal. Deve ser realizado umestudo piloto nos casos em que o protocolo não ficar consistente.

O planejamento de estudos de procedimentos indutores detumor em animais deve considerar o local de implante ou método deindução do tumor, a biologia do tumor, o potencial para lesões,desenvolvimento de metástases, produção de fatores caquéticos, estabelecimentodo desfecho mais antecipado possível, efeitos tóxicosseparados da terapia anticâncer e estabelecimento dos desfechos compatíveiscom uma avaliação confiável da eficácia da terapia em estudosiniciais.

As estratégias para minimizar o impacto de um determinadoprotocolo necessitarão ser desenvolvidas especificamente no contextode cada estudo, levando em consideração o impacto de cada um dosfatores citados.

Um elemento essencial no planejamento de estudos é o estabelecimentode desfechos humanizados e existe uma vasta discussãode como desenvolver esses desfechos.

O desenvolvimento de técnicas de imagem que permitem omonitoramento in vivo do crescimento do tumor e metástase é umavanço importante para o refinamento e controle do impacto do desenvolvimentodo tumor e para o estabelecimento de desfechos precisosem termos de crescimento, metástases e eficácia de intervençõesterapêuticas.

Os efeitos de caquexia são difíceis de administrar, mas éimportante garantir que os animais recebam uma dieta nutricionalmenteadequada. Também é importante reduzir os efeitos de outrascausas de perda de peso, como o uso profilático de líquidos parenteraisem casos de radioterapia.

Outros aspectos a serem considerados incluem o delineamentoestatístico para garantir a utilização mínima de animais, ocuidado animal, o alojamento de animais, o estresse social decorrentedos efeitos de isolamento de estudos da função imunológica e crescimentodo tumor e o potencial para essas influências de perturbar ainterpretação da eficácia da quimioterapia.

XI. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS

Os anticorpos são imunoglobulinas séricas com especificidadede ligação para antígenos específicos.

Embora os anticorpos possam ser identificados no soro deindivíduos e animais doentes que tenham sido expostos a determinadosagentes patogênicos, os métodos usuais para eliciar anticorposenvolvem a imunização com preparações de antígenos purificados ouparcialmente purificados. Os antígenos mais frequentemente utilizadossão proteínas ou peptídeos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos,pequenas moléculas orgânicas (haptenos) conjugados com proteínacarreadora, células, extratos de células e também tecidos.

A primeira consideração a fazer, em geral, é distinguir entreanticorpos policlonais ou monoclonais. Os anticorpos policlonais sãoparticularmente valiosos para imunoprecipitação e imunotransferência(soro terapêuticos), enquanto que os anticorpos monoclonais podemter excelentes especificidades e pode ser aplicado para quase qualquerfinalidade.

A escolha da espécie animal a ser utilizada para a imunizaçãoé baseada, em parte, na capacidade de gerar anticorpos degrande especificidade para antígenos geneticamente definidos que podemnecessitar de uma produção em larga escala com desejável reatividadecruzada.

A quantidade de anticorpo necessária também deve ser avaliada.Os clones de hibridomas (somática híbridos de células B debaço e de mieloma de tumores de um animal imunizado são permissivaspara a produção de imunoglobulinas monoclonais) fornecemuma quantidade bastante limitada e essencialmente tem reatividadepara apenas um epítopo. No entanto, o investimento inicial na produçãode um anticorpo monoclonal é grande, ao passo que quantidadesrelativamente abundantes de um antissoro policlonal podemser obtidas a partir de um único coelho ou a partir de vários camundongosou ratos geneticamente idênticos ou ainda cavalos.

A seguir, descreveremos a produção de antissoros policlonaispor imunização com antígenos emulsionado em adjuvante. O métododescrito é aplicável a coelhos, a camundongos, a ratos e a hamsters,e também pode ser utilizado em animais maiores, tais como carneirosou cabras e cavalos.

É importante salientar que as emulsões de Freud completo eincompleto não são mais permitidas para obtenção de antissoros policlonais,pois a sua composição a base de lanolina e parafina, bemcomo, na chamada formulação completa, é acrescida de células deMicobacterium bovis inativado pelo calor. Todas essas substânciassão extremamente inflamatórias e levam a reações doloridas, levandoao sofrimento do animal. Pode se usar emulsões com base de óleosbrancos de qualidade farmacêutica (ex: Marcol® - Exxon) e substânciassurfactantes de aplicação farmacêutica (Span 80®, tween80®), ou ainda óleos biodegradáveis, como o esqualeno.

Os protocolos detalhados para a produção de anticorpos monoclonaissão fornecidos a seguir. Com pequenas modificações, osprotocolos podem ser aplicáveis a camundongos, ratos e hamsters.

Uma boa produção de antissoros depende, em grande parte,da qualidade, pureza e quantidade de antígeno disponível, bem comosobre a especificidade e sensibilidade do ensaio. Para antígenos deproteínas, se possível, o material deve ser homogêneo e bioquimicamente,dependendo da utilização pretendida, pode estar em umaconformação nativa ou desnaturada.

Deve-se estar ciente de que os contaminantes são frequentementepresentes, porém, em menores quantidades de antígenos queo imunógeno de interesse, e a partir da imunização os antissorosresultantes podem ter mais atividade contra os contaminantes do quecontra a proteína de interesse.

O antissoro a ser utilizado para o rastreio de bibliotecas deexpressão de cDNA de bactérias ou por imunomarcas são melhorrealizadas contra a proteína desnaturada, enquanto que os que seutilizam para o rastreio de cDNA expressos em sistemas de transfecçãoeucarióticas ou para imunoprecipitação de estruturas de célulasnativas sintetizado pode ser feita melhor contra a proteína nativa.

Embora os avanços oferecidos pelo desenvolvimento de técnicasde anticorpos monoclonais têm revolucionado a especificidade,a uniformidade, e a quantidade de anticorpos, existem muitas circunstânciasem que os anticorpos policlonais são mais desejáveis doque os anticorpos monoclonais. Produção de antissoros policlonaisleva menos tempo e esforço do que a produção de anticorpos monoclonais,exige um equipamento relativamente simples e prontamentedisponível e produz reagentes que podem ser utilizados paraimunoprecipitação, imunotransferência e ensaio imunoenzimático(ELISA).

A escolha do animal para a produção de anticorpos dependeda quantidade desejada de antissoro, da distância evolutiva entre asespécies, a partir do qual a proteína de interesse foi derivada e daespécie do animal a ser imunizado e experiência prévia com osimunógenos. Os coelhos são os animais de escolha, porque eles sãogeneticamente distintos das fontes de proteínas humanas e de camundongos,os quais possuem as proteínas mais estudadas. Coelhospodem fornecer até 25 ml de soro, sem efeitos prejudiciais significativosaos animais.

Quando for utilizada pequena quantidade de antissoro oupara aqueles que dependem de anticorpos com especificidades precisamentedefinidas, linhagens puras de animais podem ser o sistemade escolha. Porque camundongos são menores, o volume de suspensãode antígeno utilizado para a imunização é significativamentemenor e a quantidade de soro que pode ser obtido a partir de umaúnica punção não é superior a 0,5 ml. Os ratos e hamsters podem serusados, quando for necessárias quantidades de soro maior, ou quandoa maior distância evolutiva é vantajosa. Com punção repetida, podeser obtido até 5 ml de soro a partir destas espécies.

Na presença de adjuvante (emulsões ou hidróxido de alumínio),o antígeno à base de proteína é aplicado por via intramuscular,intradérmica, subcutânea, conforme protocolo sob supervisãode médico veterinário, na espécie escolhida de animal. Imunizações

de reforço são iniciadas 4 a 8 semanas após a imunização primária econtinua em intervalos de 2 a 3 semanas. Antes da primeira imunizaçãoe de cada imunização de reforço, é obtido o sangue do animale o soro preparado a partir de sangue total.

11.1. Materiais - Coelho, camundongo, rato ou hamster

a) adjuvante (ISA 52® - Seppic®, Hidróxido de Alumínio);

b)1 a 2 mg/mL de antígeno de proteico em tampão salinafosfatada(PBS) purificado;

c) tubos de 50 ml para centrífuga de polipropileno descartáveis;

d)seringas descartáveis de 3 ml;

e) conector hub com bloqueio duplo-end (Luer-Lok, BectonDickinson) ou torneira plástica de 3 vias para conexão para seringa;

f)reagentes adicionais e equipamentos para a contenção doanimal, material para injeção parenteral e coleta de sangue.

11.2. Produção de Anticorpos Policlonais em Coelhos comadjuvante oleoso (emulsão)

a) obter de 0,5 a 2,0 mg de antígeno em 1,0 mL de PBS;

b) misturar com 1,0 mL de adjuvante oleoso (ex: ISA-52);

c) emulsificar com duas seringas de 5,0 mL conectados comhub duplo-end ou com torneira plástica de (três) vias;

d) após 5 minutos, colocar 1 (uma) gota da emulsão em umasuperfície de água. Caso a emulsão se disperse, a emulsificação deverácontinuar por mais cinco minutos, até que o a emulsão nasuperfície da água não se disperse;

e) o antígeno emulsificado poderá ser inoculado até 0,5 mLda seguinte forma:

1. no músculo semitendíneo ou músculo grácil;

2. subcutâneo, em até 100mL em 10 pontos no dorso (totalde 1,0 mL).

f) após 21 dias, repetir a imunização sem adjuvante;

g) após 28 dias da primeira imunização, repetir a imunizaçãosem adjuvante;

h) após 35 dias da primeira imunização, obter uma pequenafração de soro determinar o título de anticorpos;

i) se o título de anticorpo não for suficiente, imunizar após36 dias da primeira imunização;

j) repetir o item 8, após 45 dias da primeira imunização.

11.3. Produção de Anticorpos Policlonais em Coelhos comhidróxido de alumínio

Observação - O hidróxido de alumínio deve ser usado deacordo com a concentração de alumínio que não deve ser superior de1,25 mg por dose.

Existem diversas marcas de hidróxido de alumínio para formulaçãode antígenos vacinais. As preparações estão muitas vezes naforma de gel de hidróxido de alumínio, o que indica que estão naforma de suspenção, devendo então ter sua concentração conhecida,observando-se condições abaixo:

a) separar de 0,3 a 1,5 mg de hidróxido de alumínio estéril (ovolume dependerá da concentração do gel);

b) misturar de 0,5 a 2,0 mg de antígeno proteico em condiçõesassépticas (dependente do volume, quanto maior o volumemaior a concentração de antígeno);

c) manter a temperatura ambiente em constante agitação (osuficiente para não precipitar o gel);

d) inocular por via intramuscular no máximo 0,25mL ou viasubcutânea no máximo 0,1mL.

1. no músculo semitendíneo ou músculo grácil;

2. subcutâneo, em até 100L em 10 pontos no dorso.

e) após 21 dias, repetir a imunização sem adjuvante;

f) após 28 dias da primeira imunização, repetir a imunizaçãosem adjuvante;

g) após 35 dias da primeira imunização, obter uma pequenafração de soro determinar o título de anticorpos;

h) se necessário, imunizar após 36 dias da primeira imunização;

i)repetir o item 8, após 45 dias da primeira imunização.

11.4. Produção de Anticorpos Policlonais em camundongocom adjuvante oleoso (emulsão)

a) obter de 10 a 50g de antígeno em 1,0 mL de PBS;

b) misturar com 1,0 mL de adjuvante oleoso (ex: ISA-52);

c) emulsificar com duas seringas de 3,0 mL conectados comhub duplo-end ou com torneira plástica de três vias;

d) após 5 minutos, colocar 1 gota da emulsão em uma superfíciede água. Caso a emulsão se disperse, a emulsificação deverácontinuar por mais cinco minutos, até que o a emulsão na superfícieda água não se disperse;

e) o antígeno emulsificado poderá ser inoculado até 0,5 mLda seguinte forma:

1. via intraperitoneal;

2. subcutâneo, em até 50L em 2 pontos na base da cauda.

f) após 21 dias, repetir a imunização sem adjuvante;

g) após 28 dias da primeira imunização, repetir a imunizaçãosem adjuvante;

h) após 35 dias da primeira imunização, obter uma pequenafração de soro determinar o título de anticorpos;

i) se necessário, imunizar após 36 dias da primeira imunização;

j)repetir o item 8 após 45 dias da primeira imunização.

11.5. Produção de Anticorpos Policlonais em Camundongoscom hidróxido de alumínio

Observação - O hidróxido de alumínio deve ser usado deacordo com a concentração de alumínio que não deve ser superior de1,25 mg por dose.

Existem diversas marcas de hidróxido de alumínio para formulaçãode antígenos vacinais. As preparações estão muitas vezes naforma de gel de hidróxido de alumínio, o que indica que estão naforma de suspenção, devendo então ter sua concentração conhecida,observando-se os requisitos abaixo:

a) separar de 0,3 a 1,5 mg de hidróxido de alumínio estéril (ovolume dependerá da concentração do gel);

b) misturar de 10 a 100g de antígeno proteico em condiçõesassépticas (dependente do volume, quanto maior o volume maior aconcentração de antígeno);

c) manter a temperatura ambiente em constante agitação (osuficiente para não precipitar o gel);

d) inocular por via intraperitoneal no máximo 0,5 mL ou viasubcutânea no máximo 0,05 mL na base da cauda;

e) após 21 dias, repetir a imunização sem adjuvante;

f) após 28 dias da primeira imunização, repetir a imunizaçãosem adjuvante;

g) após 35 dias da primeira imunização, obter uma pequenafração de soro determinar o título de anticorpos;

h) se necessário, imunizar após 36 dias da primeira imunização;

i)repetir o item 8, após 45 dias da primeira imunização.

A produção de anticorpos policlonais em ratos e hamster ésimilar à produção em camundongos, sendo a quantidade de antígenopode ser de 20 a 200g e o volume máximo a ser inoculado por viaintraperitoneal é de 1,0 mL e, por via subcutânea, de 200L em doispontos na base da cauda.

XII - Estratégias de enriquecimento ambiental

Os alojamentos dos animais em cativeiro, com frequência,diferem bastante do ambiente natural, que é rico em estímulos. Atualmente,a ciência reconhece estas diferenças e incentiva a modificaçãodestes alojamentos, com o objetivo de atender às necessidades específicasde cada espécie, visto que os animais são seres complexos,com comportamento e fisiologia adaptados aos seus ecossistemas.

Enriquecimento ambiental é "qualquer medida que promovea expressão de tipos de comportamento naturais específicos da espéciee uma diminuição, se não o desaparecimento, de tipos decomportamento anormais. Deve ser baseado na promoção de umefeito positivo no bem-estar físico e psicológico do animal".

12.1. Cuidados a serem considerados para o enriquecimentoambiental

12.1.1 O enriquecimento ambiental deve ser fornecido comoparte dos cuidados de rotina dos animais. Devem ser levadas emconsideração as necessidades comportamentais específicas da espécie,incluindo a disponibilidade e desenho de espaço que permita livremovimentação e atividade, sono, privacidade e contato com outros damesma espécie.

12.1.2. É importante observar que espécies diferentes necessitamde diferentes ambientes sociais e, portanto, de diferentestipos de enriquecimento ambiental. Também é importante observarque o enriquecimento ambiental deve ser realizado com cautela, poisele pode causar danos indesejados aos animais e introduzir variabilidadecapaz de interferir nos resultados da pesquisa.

Interação com o homem é importante para o bem-estar dosanimais e também pode afetar os resultados. Os animais devem seradaptados à presença humana em geral e, especificamente, aos técnicose pesquisadores. Para evitar dor e desconforto, todo o manuseioe imobilização devem ser feitos da forma mais positiva, segura e livrede ameaças e por pessoas treinadas para este fim.

12.1.3. A mudança para um ambiente enriquecido deve ocorrercom cautela e ser iniciada também no âmbito administrativo, comsua inclusão de orçamento destinada a estas estratégias de promoçãodo bem-estar.

12.2. Sugestões de enriquecimento ambiental para roedores elagomorfos

12.2.1. Enriquecimento ambiental para roedores

12.2.1.1. Social:

Ratos e camundongos são espécies altamente sociais e secomportam melhor quando alojados em pares ou em grupo. O melhormomento para a formação dos grupos é o momento do desmame.

Uma grande atenção deve ser dada aos grupos formados porcamundongos machos. Quanto mais velho for o camundongo, maior aocorrência de problemas de agressão. Devemos ter como regra quegrupos de indivíduos do mesmo sexo devem ser formados antes dapuberdade. A organização territorial e social apresenta diferençasentre as linhagens de camundongos. Os machos adultos da linhagemSwiss demonstram maior intolerância uns com os outros no estabelecimentode territórios e apresentam maior grau de agressividadequando comparados a outras linhagens. Adicionar ou remover umindivíduo pode afetar o bem-estar do grupo inteiro.

A Cobaia é uma espécie social e deve ser alojada em paresou pequenos grupos de indivíduos compatíveis sempre que possível.Machos frequentemente brigam quando atingem a maturidade sexuale devem então ser separados.

Na natureza, o hamster normalmente tem um comportamentosolitário e agressivo uns com os outros, marcando seus territórios pormeio das glândulas odoríferas em seus flancos. Recomenda-se, quandonecessário, alojar hamster em grupos do mesmo sexo, formadodurante o desmame.

12.2.1.2. Relação homem-animal:

Conduza o manejo diário de forma sistemática e suave eevite procedimentos os quais possam causar estresse.

Para familiarizar o rato ou camundongo com o técnico, devesepermitir que o animal explore seu manuseador. Adaptar os animaispara acostumar-se a procedimentos que necessitem ser repetidos. Nomomento da retirada da tampa das gaiolas, insira a mão dentro dagaiola e permita a proximidade do animal, permita que ele se acostumea este procedimento.

O manuseador do animal pode ser uma fonte de enriquecimentosocial. A implantação de reforço positivo ou agrados após otérmino da atividade é recomendado para todas as espécies.

12.2.1.3. Alimento:

Roedores preferem buscar seu próprio alimento. Quando permitidopela proposta do estudo e resguardados os cuidados comproblemas de contaminação, sementes podem ser espalhadas na cama,o que permite a busca pelo alimento. Outra forma de enriquecimentoalimentar é espalhar sementes por cima do alimento peletizado. Algumasirão cair por entre os espaços, mas a maioria ficará presa entreos pellets.

Sempre que possível, ofereça alimentos alternativos além daração peletizada, desde que não interfira na proposta em estudo.

Para cobaias, pode ser oferecido feno dentro da gaiola; folhasverdes podem ser dadas como um suplemento a uma raçãobalanceada. Esta espécie reluta em comer alimentos desconhecidos euma mudança rápida na dieta pode causar perturbações digestivas.Portanto, introduza novos alimentos de forma gradativa. Uma vez queos animais estejam acostumados, pode-se ter uma variedade de alimentosoferecidos como agrado em forma de rodízio.

Mistura de sementes podem ser dispostas no piso da caixaalimentação de hamsters jovens. Entretanto, os animais comerão principalmentesementes de girassol e excluirão outras. Estratégias alimentarespoderão ser benéficas para o bem-estar dos animais. Noentanto, o controle de qualidade de tais sementes é essencial, uma vezque existe o potencial de contaminação química ou biológica. Estaprática pode ser contraindicada para animais em estudos nutricionaisou de toxicologia.

12.2.1.4. Ambiente físico:

Ratos e camundongos são animais noturnos e buscam esconder-seda luz e buscar abrigo. O fornecimento de tubos de PVC ououtro material resistente propicia abrigo durante o dia. O fornecimentode uma folha de papel toalha é uma excelente forma deincentivar o comportamento de nidificação, típico de roedores.

O aumento do espaço, propiciando diferentes níveis dentroda gaiola, ou o fornecimento de objetos, para os animais escalarem ouse exercitarem, também pode ser oferecido. Quando estão se movendo,camundongos preferem ficar em contato com uma parede elonge de espaços abertos. Fornecer divisórias na gaiola pode fazer ocamundongo sentir-se mais seguro.

Brinquedos de atividade, como cordas, objetos de borracharesistentes a mordidas que possam ser autoclavados podem ser introduzidos.

Umacaixa de nidificação sólida e opaca, com uma partesuperior, pode ser colocada na gaiola de ratos, permitindo que eles autilizem como plataforma.

Cobaias demonstram boa aceitação por caixas de papelão ouplástico que fornecem um abrigo escuro e escondido de outros indivíduos.Estas caixas servem como um lugar para se esconder ecomo um lugar seguro para o parto.

A presença de abrigos reduz a agressividade em hamsters.Estes abrigos permitem que eles se escondam uns dos outros, ajudandoa minimizar encontros agressivos. Abrigos que simulem umtúnel escuro é o mais desejável.

Rodas de correr podem ser oferecidas para camundongos ehamsters e os animais normalmente as utilizam extensivamente. Noentanto, existem controvérsias sobre os benefícios destas rodas. Elaspodem ser vistas como uma maneira de proporcionar atividade física,mas, por outro lado, pode ser considerado como um facilitador paraum comportamento obsessivo, já que os animais se exercitam mais doque normalmente se exercitariam na natureza.

12.2.1.5. Estimulação olfatória:

Marcações olfativas são muito importantes para roedores esão a base do desenvolvimento de sua organização social. A agressividadeem machos é comum após a limpeza da caixa, pois a marcaçãodo cheiro territorial é alterada.

Atenção especial deve ser dada ao fato de que ratos sãopredadores naturais de camundongos. Portanto, o cheiro de ratoscausará uma reação de medo no camundongo. Logo, essas duas espéciesnão devem ser alojadas juntas.

Adicionar papel toalha após a limpeza da gaiola reduz acarga olfatória e encoraja o comportamento de nidificação.

As cobaias e os hamsters devem ser capazes de mantercontato olfativo com outros animais familiares.

12.2.1.6. Promoção de tipos de comportamento naturais:

A luz ambiente deve funcionar em ciclo dia-noite, preferencialmentecom escurecimento gradual para imitar o nascer e o pordo sol para os roedores. Sistemas de dimerização podem ser previstos.

Ofornecimento de materiais para nidificação tais como lenços,feno, papel toalha, tiras de papel ou algodão, deve ser incentivado.Os camundongos construirão ninhos com esses itens comentusiasmo, mas também utilizam para se abrigarem da luz ou outrosestímulos estressantes.

Tipos de comportamento naturais, como cavar e criar túneispodem ser estimulados se for fornecido um substrato que tenha várioscentímetros de espessura. Objetos para mastigar, tais como blocos demadeira com buracos pré-existentes, bolas de golfe ou bolinhas demadeira, blocos de madeira macia, palha ou tubos de papelão. Tubosde papelão também fornecerão abrigo e uma oportunidade para escalar.

Forneçaaos ratos uma maior complexidade estrutural, utilizandoabrigos com plataformas.

12.2.2. Enriquecimento ambiental para coelhos

12.2.2.1. Social:

Em seu habitat, os coelhos são animais sociais e, em muitoscasos, vivem em tocas de até 100 ou mais animais de várias idades.Alojamento em grupos proporciona aos animais a oportunidade de umcomportamento social mais próximo do natural, incluindo uma amplaoportunidade para o exercício adequado, limpeza mútua e melhora nobem-estar geral. Coelhos alojados em grupo realizam uma higiene grupal,que é um comportamento importante e aumenta a coesão do grupo.

Os coelhos podem também ser alojados em pares com gaiolasinterconectadas. Animais alojados individualmente devem ter contatovisual e olfativo com outros coelhos.

12.2.2.2. Humano-animal:

O homem também pode ser uma fonte de enriquecimentosocial. A remoção frequente da gaiola para manuseio e o contato comos cuidadores é recomendada. Deve se ter uma relação de carinhocom os animais, manuseando-os com segurança e minimizando oestresse da contenção.

12.2.2.3. Alimento:

Feno pode ser fornecido no topo da gaiola para que o coelhofique em uma posição bípede para sua obtenção. Uma variedade desuplementos alimentares, como cenoura, maçã, verduras e outros vegetais,podem ser servidas em rotação, além da ração formuladabalanceada. Agrados alimentares podem ser espalhados pelo localonde os animais estão confinados, para permitir a busca por comida,sempre que a proposta em estudo e o procedimento operacional padrãopermitirem.

12.2.2.4. Ambiente físico:

A dimensão dos recintos de alojamento deve permitir osdiversos movimentos dos animais. Plataformas ou caixas colocadasentre 20 e 30 cm acima do chão fornecem um bom abrigo escuro.Bolas e pesos de polipropileno resistentes a mordidas servem comobons brinquedos, bem como correntes de aço inoxidável suspensascom madeiras penduradas.

12.2.2.5. Estimulação olfatória:

O coelho tem uma alta sensibilidade olfativa, o que é deextrema importância no comportamento social e sexual. Portanto,deve-se evitar o uso de substâncias químicas de odor forte. Os coelhosdevem ser capazes de manter contato olfativo com outros animaisfamiliares.

12.2.2.6. Promoção de tipos de comportamento naturais:

Galhos, gravetos e caixas de papelão não tóxicos devem serfornecidos para os animais roerem. Caixas de nidificação devem serpreenchidas com feno, palha ou retalhos de papel para as fêmeasprenhes.

Tabela 7 - Estratégias de enriquecimento ambiental para espéciesanimais utilizados em pesquisas.

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E-mail: dasieinternational@hotmail.com

- Digital Material for Trainers: A series of 12 digital videoCDs covering handling, procedures, anaesthesia and surgery for commonlaboratory animals. Three CDs include interactive course notes.Purchasing information

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- Pain Assessment in the Rat. John Roughan and Paul Flecknelldeveloped this CD that contains movies illustrating a behaviour-basedpain scoring scheme in rats. Purchasing information availableat: http://www.lal.org.uk/digital/digital.html

- Principles of Surgery: This website from the University of PennsylvaniaSchool of Veterinary Medicine includes videos of suture patterns and techniques.

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- Training in Basic Biomethodology for Laboratory Mice: National Human Genome ResearchInstitute, Office of Laboratory Animal Medicine, National Institutes of Health. Request for copies shouldbe sent to: rodent-cd@mail.nih.gov

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Tabela 1 A: Recomendações de locais de coleta de sangue para roedores e coelho.

- não recomendado; + via possível; ++ via aceitável; +++ via de preferência;* somente sobanestesia; ** Somente sob anestesia.

Tabela 1B: - Métodos e vias comuns de administração de substâncias nos roedores e lagomorfos(sítio de administração, máximo de volume aceito e tamanho da agulha)

Fonte: Adaptado de CCAC (1993)

Tabela 2: Procedimento para minimizar a dor e o distresse ao administrar substâncias

Tabela 6 - Procedimentos para minimizar a dor e o desconforto ao modificar o comportamento

Figura 1 - Exemplo de opções de controle da dor classificados de acordo com o potencial doprocedimento em resultar dor ou estresse ("grau de invasividade"). AINES: Anti-inflamatórios nãoesteroides

Figura 2 - Locais de ação de agentes analgésicos nos mecanismos da dor.Fonte: Modificado de Schofield e Williams (2002)http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/animalwelfare/analgesic- practice.pdfTabela 8: Minimizando os riscos cirúrgicos ao bem-estar animal

Tabela 7: Estratégias de enriquecimento ambiental para espécies animais utilizados em pesquisas.

Tabela 3: Fármacos analgésicos e sedativos mais usados em animais roedores e lagomorfos,com suas respectivas doses, vias e periodicidade de tratamento

Vias: IM - intramuscular; IV - intravenosa, SC - subcutânea e VO - oral

Observações: Esta lista não é completa e as doses são apenas um guia geral. Há uma grandevariação entre linhagens e animais. Recomendam-se consultas adicionais sobre sedação e analgesia daespécie alvo. Estes fármacos e doses não garantem sedação ou analgesia eficaz. É necessário adequar osfármacos e posologia de acordo com o grau de invasibilidade do procedimento e o animal e para tal éfundamental a qualificação em reconhecer os sinais de dor na espécie. Outros fármacos não listadospodem ser administrados desde que apresentem eficácia em outras espécies e as doses sejam ajustadas.

Fontes: Flecknell (1996), Kohn et al (1997), Hawk et al (2005)

Tabela 4: Fármacos e associações de fármacos injetáveis mais usados para contenção química eanestesia de animais roedores e lagomorfos, com suas respectivas doses e vias

Vias: IM - intramuscular. IV - intravenosa e SC - subcutânea

Observações: Esta lista não é completa e as doses são apenas um guia geral. Há uma grandevariação entre linhagens e animais. Recomendam-se consultas adicionais sobre anestesia da espécie alvo,técnicas e fármacos. Estes fármacos, doses e técnicas não garantem anestesia eficaz. É necessárioadequar os fármacos e posologia de acordo com o grau de invasividade do procedimento e o animal epara tal é fundamental a qualificação em reconhecer os planos anestésicos e a monitoração da profundidadeanestésica na espécie. Outros fármacos não listados podem ser administrados desde queapresentem eficácia em outras espécies e as doses sejam ajustadas.

Fontes: Flecknell (1996), Kohn et al (1997), Hawk et al (2005).

Tabela 5: Anestésicos inalatórios mais usados e suas respectivas concentrações para indução emanutenção da anestesia de animais roedores e lagomorfos.

Observações: Esta lista não é completa e as concentrações são apenas um guia geral. Há umagrande variação entre linhagens e animais. Recomendam-se consultas adicionais sobre anestesia daespécie alvo. Estes fármacos e concentrações não garantem anestesia eficaz. É necessário adequar aconcentração do fármaco de acordo com o grau de invasividade do procedimento e o animal e para talé fundamental a qualificação em reconhecer os planos anestésicos e a monitoração da profundidadeanestésica na espécie.

Fontes: Flecknell (1996), Kohn et al (1997), Hawk et al (2005).

GILBERTO KASSAB

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